HPLC法同時測定復方黃藤洗液中3個有效成分及2種防腐劑的含量

黃慧，孫煜，何虹，盧日剛

(1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530299；2.廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530022)

復方黃藤洗液具有清熱解毒，殺蟲止癢的功效,主要用于濕熱帶下(外陰炎，陰道炎)和皮膚瘙癢等癥的輔助治療，其處方由牛白藤、漆大姑、梔子、黃芩、土茯苓、白及、蛇床子、黃藤、桉油、冰片、醋酸氯己定組成，并加入苯甲酸鈉和羥苯乙酯作防腐劑。黃藤是我國傳統中藥,其有效成分鹽酸巴馬汀具有抗炎、抑菌等作用[1]，黃芩苷為方中黃芩的主要有效成分，其藥理作用廣泛，包括抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[2]。醋酸氯己定作為常用抗菌劑或消毒劑,具有很強的抑菌作用和較好的殺菌效果，并且有研究證明含醋酸氯己定成分的洗液在婦科炎癥的治療中療效顯著[3-4]。

處方中苯甲酸鈉和羥苯乙酯是常用的化學防腐劑，均對人體有一定毒性，用量過多可能危害人體健康，導致患者出現皮膚刺激或過敏，羥苯酯類的過量使用還可能有類激素作用，增加乳腺癌風險[5]；而用量不足，防止微生物污染的能力不足，又可能導致藥品霉變、酸敗，直接影響藥物的產品質量和用藥安全[6]。

復方黃藤洗液現行標準只規定了鹽酸巴馬汀含量的測定方法，尚未見同時測定復方黃藤洗劑中鹽酸巴馬汀、黃芩苷和醋酸氯己定3個成分的報道，也未見對其防腐劑的研究。為有效控制藥品質量，保證其療效，本研究在參考文獻[7-9]的基礎上，采用 HPLC 同時測定復方黃藤洗劑中3個有效成分(鹽酸巴馬汀、黃芩苷和醋酸氯己定)及2種防腐劑(苯甲酸鈉、羥苯乙酯)含量，為復方黃藤洗劑標準的提高提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS205DU電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀(含 DAD 檢測器，美國賽默飛世爾公司)；Milli-Q A10超純水機(美國密理博公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(批號：110715-202122，含量：94.2%，)、苯甲酸鈉對照品(批號：100433-201702，含量：99.7%)、鹽酸巴馬汀對照品(批號：110732-201913，含量：85.7%)、醋酸氯己定對照品(批號：100183-201604，含量：96.3%)、羥苯乙酯對照品(批號：100847-201604，含量：99.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(德國默克公司，色譜純，批號：JA090630)；三乙胺(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20190130)；磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：201881109)；復方黃藤洗液(廣西德聯制藥有限公司，批號：20200403、20200404、20200405)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Xbridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；0.01 mol·L-1磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g，加800 mL水溶解，加入5 mL三乙胺，再加水稀釋至1 000 mL，用磷酸調節pH值至2.80)為流動相A，乙腈為流動相B，流速為1.0 mL·min-1；待鹽酸巴馬汀出峰后，立即按表1進行梯度洗脫；檢測波長為230、259、274 nm，其中230 nm檢測苯甲酸鈉，259 nm 檢測醋酸氯己定、羥苯乙酯，274 nm檢測黃芩苷、鹽酸巴馬汀。進樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 稱取各對照品適量，置于量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為各對照品儲備液(各組分質量濃度分別為黃芩苷0.192 3 mg·mL-1、鹽酸巴馬汀0.412 0 mg·mL-1、醋酸氯己定0.207 2 mg·mL-1、苯甲酸鈉1.626 3 mg·mL-1、羥苯乙酯0.206 2 mg·mL-1)。精密量取各組分對照品儲備液各1.5 mL，置于同一20 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品搖勻，精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 稀釋液的制備 稀釋液為0.01 mol·L-1磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g，加800 mL水溶解，加入5 mL三乙胺，再加水稀釋至1 000 mL，用磷酸調節pH值至2.80)-乙腈(75∶25)。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取混合對照品溶液、供試品溶液及溶劑空白，按“2.1”項下色譜條件測定并記錄色譜圖，結果見圖1。結果顯示，供試品溶液中各成分在對照品相同保留時間處均有相應的色譜峰，且溶劑空白無干擾，在該色譜條件下，黃芩苷、鹽酸巴馬汀、醋酸氯己定、苯甲酸鈉、羥苯乙酯與其他成分均可達到基線分離，分離度均>1.5，具有良好的分離效果。用 DAD檢測器進行峰純度檢查，純度因子均滿足閾值限值要求(閾值為990)。

2.3.2 線性關系考察 取“2.2.1”項下各組分對照品儲備液，用稀釋劑稀釋成不同質量濃度的混合對照品標準曲線溶液，按“2.1”項下色譜條件，進行測定。分別以對照品的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行回歸分析。結果顯示，各組分在相應的濃度范圍內線性關系良好(見表2)。

表2 各組分線性關系

2.3.3 密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續測定6次，測定峰面積，以峰面積考察精密度，黃芩苷、鹽酸巴馬汀、醋酸氯己定、苯甲酸鈉、醋酸氯己定、峰面積RSD分別為0.13%、0.09%、0.10%、0.13%、0.10%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取供試品(批號：20200403)，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果黃芩苷的平均含量為0.23 mg·mL-1，RSD為0.7%(n=6)，鹽酸巴馬汀的平均含量為0.57 mg·mL-1，RSD為0.4%(n=6)，醋酸氯己定峰的平均含量為0.22 mg·mL-1，RSD為0.4%(n=6)，苯甲酸鈉的平均含量為1.88 mg·mL-1，RSD為0.6%(n=6)，羥苯乙酯的平均含量為0.21 mg·mL-1，RSD為0.4%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號：20200403)，按“2.1”項下色譜條件，在0、2、5、8、12、16、20、24 h時進樣測定，測得黃芩苷、鹽酸巴馬汀、醋酸氯己定、苯甲酸鈉、羥苯乙酯峰面積RSD分別為0.3%、0.3%、0.3%、0.4%、0.3%、0.3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.6 加樣回收率試驗 采用加樣回收率試驗方法，取同一批供試品(批號：20200403)1.5 mL 9份，每3份平行，分別置50 mL量瓶中，按對照品加入量約相當于所取供試品中待測組分量的50%、100%、150%分別精密加入各對照品儲備液適量，并加稀釋劑定容至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件測定，按外標法以峰面積計算回收率，結果見表3。

2.3.7 樣品含量測定結果 取樣品3批，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進行測定，另取對照品溶液同法測定。按外標法以峰面積計算含量，結果見表3。

表3 各組分含量測定結果

表3 加樣回收率試驗結果(n=9)

3 討論

3.1 波長的選擇 結合高效液相色譜檢測得到的5種成分 DAD 紫外吸收圖譜，在該色譜條件下，黃芩苷在274、344 nm的波長處有最大吸收，鹽酸巴馬汀在227、274、344 nm的波長處有最大吸收，醋酸氯己定在232、259 nm的波長處有最大吸收，苯甲酸鈉在274、344 nm的波長處有最大吸收，羥苯乙酯在274、344 nm的波長處有最大吸收。為使各組分的檢測均有較大的吸收，最終選定230、259和 274 nm 作為測定波長。其中，230 nm作為苯甲酸鈉的檢測波長；259 nm 作為醋酸氯己定及羥苯乙酯的檢測波長；274 nm 作為黃芩苷及鹽酸巴馬汀的檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇 比較了不同品牌色譜柱Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Kromasil 100A C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)的使用情況，二者均能有效分離各組分，各組分出峰順序稍有差異，但均能達到基線分離，分離度均符合要求，各組分峰形也較好。

4 結論

本研究建立的高效液相色譜法能夠有效分離并同時測定復方黃藤洗劑中3個有效成分(鹽酸巴馬汀、黃芩苷和醋酸氯己定)及防腐劑(苯甲酸鈉、羥苯乙酯)含量，方法操作簡單，專屬性強，準確度高，為更全面的控制本品種的質量提供了科學依據。