米力農生產工藝中新化合物的形成與環化機制及其結構推測

唐斌，徐偉，叢艷，權曉丹*，趙學清*

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.黑龍江三元陽普醫藥有限公司，黑龍江 哈爾濱 150070)

在制藥工業歷史上，美國從1966年至1984年、日本從1971年至1998年完成了已上市仿制藥的一致性評價[1]。中國為了提高仿制藥的質量與安全性，2015以來，從國家層面上強烈推動了開展仿制藥的一致性評價工作[2]。

米力農(見圖1)的注射劑于1986年在美國上市，用于治療心臟衰竭，2003年其仿制藥在中國上市。此藥物需重新進行一致性評價，這涉及對米力農的原料藥進行全面的質量研究，建立嚴格的質控及質量標準等。

圖1 米力農的工業化路線

在對合成米力農的主要原料及中間體2～5進行結構確證時，我們驚訝地發現工藝中所謂的米力農粗品，其中米力農含量僅25%，主要為一新化合物2，進一步研究揭示了此新結構的形成及環化成米力農的機制，而相關文獻中未有報道[3-4]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 核磁共振儀AVANCE Ⅲ 500(德國Bruker公司)；紅外光譜儀Nicolet is5(美國Thermo Fisher Scientific公司)；高分辨質譜儀Agilent 6520(德國Bruker公司)；高效液相色譜儀LC-2010A HT(日本Shimadzu公司)。

1.2 材料 無水乙醇(廣東光華科技股份有限公司)；甲醇鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；冰醋酸[阿拉丁試劑(上海)有限公司]；原料4、丙二腈及用于測定1H-NMR的“米力農粗品”(哈爾濱三聯藥業股份有限公司)。

1.3 方法 分析方法參照《中國藥典》2020年版(二部)中米力農有關物質的測定方法。

2 試驗內容

圖2 新化合物2的高分辨質譜

圖3 新配制2的溶液即測HPLC

圖4 樣品2溶液放置4 h后的 HPLC

2.2 米力農1的制備 將上述所謂“米力農粗品”5.81 g溶于含甲醇鈉2.68 g(50.0 mmol)的甲醇(48 mL)溶液中，加熱回流30 min，析出大量固體，靜置冷卻至室溫再冰水冷卻后[反應液中反應物料的HPLC(見圖5)，歸一化方法，米力農Rt5.82 min，95.16%，[M+1]+212.081 6(見圖6)，另一未知副產物雜質Rt4.85 min，4.84%，[M+1]+131.081 5(見圖7)，計算機給出C6H4N4，可能為丙二腈兩分子縮合物)，離心、并用冷無水乙醇約10 mL 洗滌濾餅(1的鈉鹽)]，得濾餅，白色片狀晶體，純度為99.21%；1H-NMR(CD3OD，500 MHz)：δ 8.47(d，J=6.8 Hz，2H)，7.70(s，1H)，7.35(d，J=6.8 Hz，2H)，2.31(s，3H)，與米力農比較，鈉鹽使得一個H的化學位移從δ 8.19移至高場δ 7.70。

圖5 環合反應物料米力農及未知雜質的HPLC

圖6 環合反應物料的LC-HRMS中米力農峰

圖7 環合反應物料的LC-HRMS中未知副產物峰

濾餅加入純化水60 mL，攪拌使其溶解，再向溶液中加入少量活性炭，室溫下攪拌30 min，濾除活性炭、水洗。以冰乙酸調節pH至6～7，冷卻至15～10 ℃，抽濾，以少量純化水、無水乙醇洗滌后，于50～60 ℃真空干燥得1，類白色粉末3.08 g，收率53%，純度為99.86%。1H-NMR(DMSO-d6)：δ 8.63(d，J=6.6 Hz，2H)，8.19(s，1H)，7.44(d，J=6.6 Hz，2H)，2.33(s，3H)。再以乙醇精制得白色片狀結晶2.78 g，收率90%，純度為99.89%。

3 米力農中間體的結構解析及其形成與環化的機制推測

3.1 新化合物2的結構測定 為闡明新化合物2的結構，需制備更高純度的2：由于在溶液狀態中2很不穩定，因此中間體4與丙二腈的反應，以溫和的條件(0～5 ℃)代替回流的生產工藝條件，一旦有少許的紅色固體形成，即快速抽濾、洗滌、干燥得到2，根據氫譜的積分，2的純度可達95%(2與1的比例可達19∶1)。

作為無定型粉末，在溶液狀態下2很容易轉變成1，因此無法通過重結晶獲得可用于X-衍射測定的晶體；此外，在2的樣品溶于DMSO-d6后，需立即測定NMR圖譜，即使如此，仍有少量的2(約5%)轉變成1。測定1H-NMR圖譜的樣品直接來自反應液，其譜圖上顯示含有乙醇的H及冰醋酸的H、及少量丙二腈的H。這些雜質影響了NMR(13C-NMR、NOSEY、HSQC、HMBC)的解析，需要小心剔除與米力農、乙醇及冰醋酸的相關H及C峰。

僅根據結構測試圖譜數據，還無法推斷出2的結構，只能先根據化學反應原理推斷2的形成以及2環合成米力農的可能路徑，將推測出2的結構判別其是否符合結構測試數據。

3.2 新化合物2的形成歷程 該米力農合成方法的相關文獻中并未提及此新結構2。β-二羰基化合物或β功能化的α,β-不飽和酮，與丙二腈或有關化合物已被廣泛應用于2(1H)-吡啶酮以及其他雜環化合物的合成[5-11]。同時，有關反應的機制也得到廣泛深入的研究與闡明。結合各種結構測試數據，我們推測2的形成過程如下：

在醋酸的存在下，4與丙二腈進行Aldol加成反應形成6，再酸性消除一分子乙醇，并發生雙鍵轉移得到醛8，8再繼續與一分子丙二腈進行Aldol加成形成2(見圖8)。由于2在反應介質中溶解度很差，一旦形成就沉淀下來。

圖8 新化合物2的形成歷程

此中試“米力農粗品”中，核磁共振圖譜中2與1的摩爾比例為75∶25，中間產物2消耗了一分子丙二腈，這也解釋了為何丙二腈單耗1.77 eq時，“米力農粗品”的收率最高，因為2的結構多消耗了大約0.7 eq的丙二腈。

3.3 不同條件下新化合物2的環合機制

3.3.1 在酸性及近中性條件下 固體狀態的2相對穩定，但有趣的是在溶液狀態下，無論是酸性、中性，還是堿性條件下，2都容易轉變成1。在不同酸堿條件下，轉變速度差異很大，因此我們推測在不同的條件下，轉化機制可能不同。

如在制備時的酸性溶液中(見圖9)，2快速轉變成1，前提是其處于溶解狀態；在DMSO-d6的近中性溶液中(測定核磁時)，24 h后轉變完全轉化成1；HPLC分析在pH 4～5的洗脫液乙腈-水中，大約8 h后，2完全轉變1。

圖9 酸性與近中性條件下2的環合歷程

2質子化后的9在脫水的同時，雙鍵位移與腈基的N進攻雙鍵的一個碳，形成六元環10，10捕獲一分子水形成11，化學鍵位移消除一分子丙二腈，繼而形成穩定的1。

3.3.2 在堿性條件下 2在堿性條件下，形成鈉鹽12，化學鍵位移的同時消除OH，得到13。氰基N進行Michael加成，并捕獲一分子堿形成14，經質子轉移形成15，最后化學鍵位移，消除一分子丙二腈的鈉鹽，得到穩定結構的1(見圖10)。由于有過量的堿存在，得到是1的鈉鹽，最終需酸化得到1。2環合時釋放出一分子的丙二腈，這也解釋了混合物環合時甲醇鈉消耗1.80 eq為最佳。

圖10 堿性條件下2的環合歷程

3.4 新化合物2結構測試數據的解析 分析由反應歷程推測的結構2是否與結構測試結果一致：HRMS：[M+1]+278.104 5(見圖2)，計算機給出的分子式為C15H11N5O(98%的可能性)，其比米力農多C3H2N2，與丙二腈(NCCH2CN)分子式一致。核磁共振樣品放置24 h后再測，則樣品轉化為米力農，同時釋放了一分子丙二腈。但是在甲醇鈉溶液中2轉化成米力農的反應中，反應物料的HPLC(見圖5)檢測(歸一化法)，除了米力農[LC-HRMS：Rt 5.82 min，95.16%，[M+1]+212.081 6(見圖6)]，另有一副產物[LC-HRMS：Rt 4.85 min，4.84%，[M+1]+131.081 5(見圖7)]，計算機給出的分子式C6H4N4，推測因為在強堿性的加熱條件下，環合反應釋放得到丙二腈(C3H2N2)的兩分子縮合物(見圖11)，這也是Aldol加成反應。為驗證這一轉化，采用丙二腈與甲醇鈉溶液，加熱處理，得到了同樣的縮合物。分析IR數據，3 403 cm-1為OH伸縮振動，對比米力農，2中2 186.9 cm-1峰顯得超強，為多個C≡N鍵的伸縮振動，1 655 cm-1峰極弱，可能是少量米力農雜質的酰胺C=O伸縮振動。

圖11 堿性條件下丙二腈的雙分子縮合

1H-NMR譜圖(見圖12)上除了吡啶環的4個H和CH3的H外，僅有兩個H峰：δ 6.97(s，2H)和(δ 7.91，s，H)，處于如此低場，應為烯烴上或類似烯烴的H。而碳1、4、5上的H化學位移，通常應在4～5之間。此外，13C-NMR[HSQC(見表1)及HMBC(見圖13及表1)]譜圖上δ為109.08、146.35，與其對應的碳依次為2、4位的碳，而δ 166.32為3位碳，與4位H(δ 7.91，s，1H)、CH3的H(δ 2.27，s，3H)相關。δ 88.00碳與1、5位H(δ 6.97，s，2H)相關，而4、3、1和5位碳與氫δ為何在如此低場？類似結構的文獻[5]中提出了一種設想：分子中雙鍵及孤對電子離域形成共軛的六元環(見圖14)，此時就可以解釋為何這些H與C在如此低場。

表1 新化合物2的NMR數據(DMSO-d6)

圖12 新化合物2的1H-NMR圖譜

圖13 新化合物2的HMBC局部圖

圖14 新化合物2的離域形態

4 總結

對米力農原料藥制造過程進行再評價時，發現原“米力農粗品”是一個新結構化合物與米力農的混合物。通過降低反應溫度，制備了較純的新化合物，并進行了各種結構測試。根據化學反應原理推測新化合物的形成、各種條件(酸性、中性或堿性)下環合形成米力農的歷程，同時結合結構測試數據，最后推測其可能結構式為醚化的α,β-不飽和酮原料與丙二腈進行兩次Aldol加成的產物。