裸鼠腦膠質瘤原位移植模型的建立

王卓，趙若琳，張立波

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046；2.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198)

腦膠質瘤(glioma) 是最常見的顱內惡性腫瘤，約占所有惡性腦腫瘤的80%,具有發病率高、復發率高、死亡率高和治愈率低等特點。目前膠質瘤的治療手段主要包括手術、放療和化療為主的綜合治療[1-2]。為了研究腦膠質瘤生長、轉移及治療情況，通常采用動物腫瘤移植瘤模型和人腫瘤異體移植模型，腫瘤移植部位主要在皮下。然而，皮下移植瘤模型并不能模仿人腦膠質瘤的生長環境及發生發展過程，也不能充分反映藥物的特性和療效。另外，常見的腦膠質瘤模型通常需要處死荷瘤小鼠，這樣不能實時且準確地反映腫瘤在裸鼠體內的生長狀況。因此，需要建立理想的、可靠的、重復性好的腦原位膠質瘤動物模型，以研究膠質瘤顱內生長特征及治療方法。

本文擬利用熒光素酶標記的LN229膠質瘤細胞，建立腦膠質瘤原位移植瘤動物模型，并通過動物活體成像技術觀察腦膠質瘤在裸鼠體內的生長情況[3]。通過精細的術前準備和術后護理技術，保證裸鼠顱內原位接種手術成功，確保裸鼠腦膠質瘤細胞原位移植模型的成功率及存活率，為膠質瘤臨床研究提供理想的動物模型[4-5]，也為驗證化合物的抗腦膠質瘤作用提供有效而直觀的評價方法。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級BALB/c Nude小鼠，4～5周齡，雌性，9只，平均體重16～18 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(浙)2019-0001。小鼠飼養于中國藥科大學新藥安全評價研究中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0019]，飼養室溫度：20～26 ℃，濕度：40%～70%；飼喂SPF級大小鼠生長維持飼料,自由攝取;飲水為實驗動物飲用水,飲水瓶裝，自由攝取，飼料購自北京科澳協力飼料有限公司，根據墊料情況不定期更換。

1.2 藥品與試劑 LN229-Luc細胞、熒光素酶底物均購自南京安米絡生物技術有限公司。

1.3 主要儀器設備 小動物活體成像儀(美國PerkinElmer公司，型號：IVIS Spectrum)；二氧化碳培養箱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號：3111]；全封閉組織脫水機(Saukura，型號：VIPTM5)；半自動輪轉切片機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號：美康HM340E]；全自動染色機(Saukura，型號：DRS2000)；正置生物顯微鏡(Olympus，型號：BX41)。

2 實驗方法

2.1 LN229-Luc細胞的培養 T25培養瓶復蘇培養，生長一代后，傳代10 cm皿中，并加入puromycin(3 μg·mL-1) 進行培養，對數生長期的LN229-Luc細胞計數后，取5 μL(10萬個細胞)進行顱內注射。

2.2 BALB/c Nude小鼠腦原位接種手術術前準備 手術前將房間進行紫外線照射消毒，手術物品提前高壓滅菌后放入超凈工作臺，不能滅菌的物品，如碘伏、莫匹羅星、縫合線、人工石蠟、保溫墊等酒精噴灑后經傳遞窗紫外燈消毒后使用，將手術需要的物品及調試好的立體定位儀，一起放入超凈工作臺，手術前打開超凈工作臺的紫外燈照射15 min進行消毒。

2.3 BALB/c Nude小鼠腦原位移植瘤模型的建立 收集LN229-Luc細胞，接種于裸鼠腦右側尾狀核區。手術前一天，將裸鼠禁食，手術當天，裸鼠稱重麻醉后，放在保溫墊上，頭部固定于立體定位儀上，用碘伏對頭部進行消毒后，按照矢狀中線位置縱向切開皮膚，切口長度約1 cm，根據立體定位儀解剖圖譜確定對應于右側尾狀核的位置：前囟點前1.0 mm，中線右1.0 mm，深度為硬膜下3.0 mm，以顱骨鉆鉆孔，勿損傷硬腦膜。使用10 μL微量注射器吸入5 μL含1×105LN229-Luc細胞懸液，注射細胞懸液3 min，留針2 min，鉆孔用人工石蠟封閉，用5號線縫合，切口涂莫匹羅星以防術后感染。

圖1 裸鼠顱內LN229-Luc細胞原位接種系統

2.4 術后護理 裸鼠蘇醒后放入新更換的IVC鼠盒，并給予適當保溫，每天觀察小鼠狀態，碘伏擦拭傷口，涂莫匹羅星，連續3 d，整個過程動作輕柔，保證充足的飲水和飼料。

2.5 檢測指標

2.5.1 小動物活體成像觀察 荷瘤小鼠腹腔注射熒光素底物(150 mg·kg-1)，異氟烷麻醉5 min 后，放入小動物活體成像系統進行檢測。裸鼠于腦內接種后Day14、Day21、Day28、Day35、Day42進行小動物活體成像檢查，監測腦內原位接種腫瘤生長情況。

2.5.2 體重變化觀察 接種前稱重一次，之后每周稱量一次，觀察體重變化。

2.5.3 BALB/c Nude小鼠原位移植瘤的病理形態學觀察 裸鼠于術后第42天活體成像監測后進行安樂死，解剖取出整個腦組織于福爾馬林中固定，HE染色后，進行組織病理學檢查，觀察腫瘤組織細胞形態及生長情況等。

3 結果

3.1 原位移植瘤模型小鼠觀察 BALB/c Nude小鼠腦內原位接種LN229-Luc細胞14 d后，多數小鼠出現明顯的顱內高壓癥狀，表現為食欲不振、精神萎靡、活動減退，體重下降明顯。接種21 d，裸鼠開始出現消瘦、弓背、膚色變暗，出現晚期癌癥患者的惡質化現象。并于接種35 d后，小鼠開始出現死亡，至實驗結束，共死亡4只，其余大部分荷瘤鼠狀態欠佳。接種42 d，熒光信號達到最強，隨熒光信號逐漸增強，腫瘤體積迅速增長。

3.2 體重變化 圖2結果顯示，BALB/c Nude小鼠腦內接種LN229-Luc細胞至21 d，體重呈現輕微的上升的趨勢；隨著時間延長，體重下降明顯。

圖2 荷瘤小鼠體重變化

3.3 活體成像結果 圖3顯示，通過活體成像系統觀察到BALB/c Nude小鼠腦內原位接種LN229-Luc細胞第14天(Day14)具有明顯的熒光信號，隨著時間延長，裸鼠的熒光值逐漸增加，熒光信號逐漸增強，提示隨著時間的延長，腫瘤逐漸增大。結果說明裸鼠原位移植瘤模型建立成功。荷瘤小鼠每周活體成像結果(熒光信號值)見表1。

表1 熒光信號值數據

圖3 荷瘤小鼠活體成像圖片

3.4 腦膠質瘤病理形態組織學觀察 大體形態觀察腫瘤呈橢圓形、梨形，大腦半球中部，邊界輪廓稍模糊，切開后腫瘤為實質性，可見血塊。鏡下觀察腫瘤占據右側腦大部分(見圖4A、B)，與正常腦組織分界明顯(見圖4C)；膠質瘤細胞生長活躍，呈假柵欄狀或珊瑚狀排列，密集成群，并向正常腦組織浸潤生長(見圖4D)?？梢娔[瘤細胞形態多樣，呈圓形、橢圓形、柱狀、多角形、不規則形狀等，細胞異型性高，核大，核質深染；偶見瘤巨核細胞，核分裂象明顯(見圖4E)；細胞無明顯排列方向，間質血管豐富，未見炎細胞浸潤；腫瘤可見出血、腫瘤中心壞死，腫瘤周邊腦組織細胞輕度水腫(見圖4F)，未見轉移。

A.腦膠質瘤整體觀HE;B.腦膠質瘤整體觀HE;C.腦膠質瘤邊界尚清×100 HE;D.腦膠質瘤浸潤性生長×100 HE;E.膠質瘤細胞×200 HE;F.腫瘤周邊腦組織細胞水腫×40HE

4 結論

近年來腦膠質瘤發病率逐漸升高，腦膠質瘤的基礎研究及抗腫瘤藥物的臨床前藥效學評價通常采用皮下移植瘤模型，因為血腦屏障的緣故，該模型不能準確評價藥物的抗腦瘤作用，也不能有效反映體內腫瘤的生物學進展，如血管生成、浸潤和轉移。隨著影像技術的發展，原位移植瘤模型已逐漸用于評價能透過血腦屏障的抗腫瘤藥物。在本研究中，荷瘤小鼠通過小動物活體成像實時監測腫瘤生長情況。小動物活體成像技術是近期發展起來的一種新型影像檢測技術，是檢測動物體內分子及細胞事件的強有力手段。利用生物發光成像(BLI) 可以對活體病灶的大小進行無損傷直觀準確檢測[6]，具有極高的檢測靈敏度。生物發光優點在于安全、實時、準確，為研究腫瘤的發生、發展過程和抗腫瘤藥效動物實驗提供了科學準確的依據[7]。因此被廣泛用于腫瘤轉移、基因治療、干細胞示蹤等相關研究[8]。

本實驗的優勢在于在已有的腦膠質瘤原位模型的構建方法的基礎上，對接種部位的坐標定位及術后護理進行改進和優化。將LN229-Luc細胞接種于BALB/c Nude小鼠大腦右側尾狀核，坐標為前囟點前1.0 mm，中線右1.0 mm，深度為硬膜下3.0 mm，選擇此注射點目的是保證將LN229-Luc細胞準確的移植到尾狀核內，從而保證腫瘤的生長，本研究中9只裸鼠造模后全部成瘤，成功率100%；結合精細的術后護理，存活率100%。顱內腫瘤生長穩定，荷瘤裸鼠體重在早期呈現輕微的上升的趨勢，但是裸鼠在接種21 d后，體重下降明顯；同時，從小動物活體成像結果看出，裸鼠接種21 d后，腫瘤的體積開始迅速增長。HE染色可觀察到膠質瘤呈假柵欄狀或珊瑚狀排列，密集成群，并向正常腦組織浸潤生長，膠質瘤瘤細胞生長活躍，異型性明顯，其生長特性和病理特性與人腦膠質瘤相似。本實驗9只裸鼠均于接種LN229-Luc細胞后14 d即可見腦膠質瘤形成，隨后腫瘤生長明顯加快，21 d時，裸鼠出現消瘦、弓背、激惹、癲癇等神經癥狀，35 d后開始陸續出現死亡。

本實驗建立的裸鼠腦膠質瘤原位移植模型較已有模型小鼠存活率和成瘤率高，實驗重復性好，是一種研究膠質瘤的發病機制、探索各種實驗性治療方法以及抗腫瘤藥的藥效學評價理想的動物模型。