實時熒光PCR與基因芯片法檢測人乳頭瘤病毒的方法學比較

麥艷媚 (鶴山市人民醫院，廣東 江門 529000)

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是專門感染人表皮與黏膜鱗狀上皮的一種病毒，性行為是其主要傳播途徑，其次為唾液與皮膚接觸[1]。高危型HPV感染已被證實為宮頸上皮內增生及宮頸癌發生與發展的主要致病因素，超過90%的宮頸癌與HPV感染有關，宮頸脫落細胞HPV DNA的檢測已成為宮頸癌的篩查方案與指引[2-3]。最新研究顯示宮頸癌有較長時間的可逆轉癌前病變期，及早發現及時有效治療后，患者五年治愈率達到90%。大量資料證明低危型HPV可導致生殖器尖銳濕疣，高危型HPV的持續感染是宮頸癌以及宮頸上皮內瘤變的主要致病原因[4-5]。因此，通過女性生殖道HPV檢測篩查以及分型檢測，能夠有效預防、降低宮頸癌發病率，給臨床疾病分流提供依據[6]。目前檢測HPV的方法眾多[7]，不同的HPV檢測方法，會因其對HPV亞型基因數量檢測結果的不同導致陽性檢出率出現一定差異。本研究對臨床上常用的實時熒光PCR技術與基因芯片法在HPV檢測中的效果進行比較分析。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇我院2018年6月～2020年6月期間的患者作為研究對象，所有患者均做液基細胞學檢測。年齡23～71歲，平均(37.25±7.92)歲。試劑與儀器：實時熒光PCR試劑盒由安徽同科生物科技有限公司提供，基因芯片試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供；擴增儀是安徽同科生物科技有限公司提供的TK-6000，雜交儀是深圳亞能生物技術有限公司提供。

1.2方法

1.2.1標本采集方法:所有患者用窺陰器暴露宮頸，無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦拭去除宮頸口過多的分泌物，宮頸刷刷取宮頸口的脫落細胞，細胞保存液保存待測。用含Thinprep細胞保存液再保存一份細胞用于液基細胞學檢測。

1.2.2基因芯片法:充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。把洗脫液全部轉移至1.5 ml的離心管中，13 000 rpm離心10 min，棄去上清，保留管底的細胞沉淀。加入100 μl病毒裂解液，混勻后100℃加熱10 min，13 000 rpm離心10 min，保留上清液待用。于反應Ⅰ和反應Ⅱ加入制備好的上清液各5 μl,陰陽質控品同等處理，低速離心數秒待擴增。PCR擴增儀反應條件設置：50℃15 min;95℃10 min;(94℃30 s,42℃90 s,72℃ 30 s)共40個循環，72℃ 5 min，4℃下保存。取擴增的全部PCR產物導入，將標記有HPV6、11、42、43、81、83(低危型)及16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82(高危型)等23種寡核酸探針的基因芯片，嚴格按照試劑盒進行導流雜交后，酶標儀顯色處理。觀察芯片上HPV分型分布所對應的陽性點，并對HPV亞型進行判斷，明確相應組織中的HPV亞型分布情況。

1.2.3實時熒光PCR法:按照試劑盒說明書對HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68等15種高危型HPV進行檢測。

2 結果

2.1兩種方法HPV陽性率檢測結果比較:本研究中，采用基因芯片法檢出HPV陽性率為23.29%(17/73)，其中15種高危型HPV感染的陽性率為13.70%(10/73)；差異無統計學意義(P>0.05)。同時采用兩種方法檢測的共有73例，兩種方法對15種高危型HPV檢出均為陽性的有24例，不符合的為2例。其中基因芯片法陽性率為35.62%(26/73)，熒光PCR法為32.88%(24/73)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2兩種方法在不同TCT分型中的HPV感染陽性率檢出結果比較:TCT分級各組中的基因芯片法與熒光PCR法的高危型HPV感染陽性檢出率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種方法在不同TCT分型中的HPV感染陽性率檢出結果比較[例(%)]

2.3兩種方法對HPV感染的診斷價值：基因芯片法對HPV感染陽性的診斷敏感度、特異度、準確度分別為98.75%、98.675、98.69%；熒光PCR法的敏感度、特異度、準確度分別為97.50%、99.47%、96.77%，差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

目前，HPV基因亞型已鑒定出的有100多種，有40多種HPV亞型可侵犯女性生殖道，被稱為生殖道HPV，按照其致癌性強弱又分為高危型、低危型等。多數女性HPV感染期不長，處理無臨床感染狀態、亞臨床感染狀態，當受損的宮頸上皮持續存在HPV感染情況時，會使宮頸上皮出現不典型增生，并引發癌變[5]。部分低危型如HPV6、HPV11的感染可引起尖銳濕疣，HPV16、HPV18型的持續感染被認為是宮頸癌的高危因素，可以預測子宮病變的進展和預后，因此，HPV亞型的檢測對于臨床診斷分流均有一定的參考依據。

本實驗中實時熒光PCR法是將熒光基團加入PCR反應體系中，基于多重熒光PCR技術，通過熒光信號的累積進行實時監測，在四種PCR反應混合液中分別采用四種熒光通道共檢測15種HPV及人β-珠蛋白(HBB)基因，其中HPV16/58/35/HBB-PCR反應液中FAM熒光通道檢測HPV16,接(或HEX)熒光通道檢測HPV58,ROX熒光通道檢測HPV35,CY5熒光通道檢測HBB;同樣原理能具體檢測HPV的各個亞型。實時熒光PCR能做到對15個HPV亞型的同時檢測并能分出具體型別，操作簡單，耗時短，適合做大規模的篩查?；蛐酒ㄊ遣捎肞CR體外擴增和DNA反向點雜交相結合的HPV基因分析檢測技術，將擴增產物與固定在膜條上的23種HPV分型探針雜交，依據雜交信號的有無判讀結果?；蛐酒刹捎酶咄考夹g對基因進行大規模檢測，目前被廣泛應用于腫瘤檢測與研究中[8]。Meta分析顯示，基因芯片法對HPV感染的檢測門診患者HPV感染的敏感度為0.97(95%CI:0.96～0.98)，特異度為0.96(95%CI:0.96～0.97)，診斷優勢比為878.72(95%CI:317.14～2434.73)；檢測宮頸癌患者HPV感染的敏感度為0.99(95%CI:0.97～1.00)，特異度為0.80(95%CI:0.75～0.84)，診斷優勢比為166.19(95%CI:9.64～2863.74)，具有很高的準確性，但也有一定的假陽性與假陰性情況[9]。目前研究顯示，熒光PCR法不區分亞型與基因芯片法在高危型HPV感染陽性診斷中具有很高的一致性[10]，本研究也顯示，熒光PCR法可區分亞型與基因芯片法也具有很高的一致性。本實驗中熒光PCR法采用熒光探針法通過不同熒光通道來區分亞型，操作簡單，耗時短，被用于我院的大規模人群篩查?；蛐酒ㄍ瑫r能檢測23種亞型，比熒光PCR法多8種亞型，故后者檢測陽性率對高于前者。不同亞型臨床的處理不一樣，后者更符合臨床的需求，被用于臨床對疑似HPV感染患者的檢測。

綜上所述，實時熒光PCR與基因芯片法對HPV陽性檢出情況高度一致，尤其在高危型HPV檢測中，均有良好的診斷效能，根據實際情況，合理選擇檢測方法，均能夠對宮頸病變作出及時有效的診斷。