基于多元統計分析的牛排摻假定量判別及差異分析

張穎穎，王守偉，康超娣，張明悅，李瑩瑩

（北京食品科學研究院，中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

近年來，基于質譜技術測定靶標多肽的方法已被廣泛應用于食品真偽鑒定中[1-3]，該類方法具有高熱穩定性、高靈敏度、高通量等優點，應用于多類食品，如牛奶[4]、肉制品[5-6]、動物副產品[7]。方法的基本流程[8]包括蛋白提取、胰蛋白酶酶解、高分辨質譜采集數據、專業軟件搜索數據庫進行蛋白及多肽鑒定、統計學分析。其中肉的物種特異性多肽主要來源于肌紅蛋白[9]、肌球蛋白[10]、血紅蛋白[11]、乳酸脫氫酶和肌酸激酶蛋白[12]，大豆的特異性多肽主要來源于大豆球蛋白[13]，牛奶的特異性多肽主要來源于酪蛋白[14]和乳球蛋白[15]。

目前，絕大多數靶標多肽方法主要應用于物種的定性鑒別實驗中，然而，食品摻假不僅涉及原料種類摻假，即用低價原料代替高價原料，還包括食品摻假程度的問題，如在肉制品中加入較大量的非肉蛋白（植物蛋白）替代肉的含量冒充等級高的產品，而我國針對肉制品等級的判定，如GB/T 20712—2006《火腿腸》[16]、SB/T 10610—2011《肉丸》[17]，僅能通過一些常規的參數檢測，如蛋白總量、淀粉等，而無法測定其中真正肉的含量，因此在肉制品定量檢測方面存在方法盲區。目前的定量研究主要集中于2 個方向的探討：一是相對定量法，即測定食品中不同物種蛋白含量的比例。Camerini等[18]分析意大利乳清干酪的摻假現象，從β-乳球蛋白和α-乳清蛋白中選擇了特定的肽段，以鑒定牛、水牛、綿羊、山羊源性成分，并且在1%～50%的范圍內進行曲線擬合，線性相關系數高于0.99，方法的檢出限可測定0.5%的牛乳清成分。Watson等[9]建立了一種液相色譜-串聯質譜方法判定肉制品的摻假，用各個物種特異性多肽的峰面積之比進行物種相對定量分析，分別對5%、10%、20%、50%、80%和90%的馬肉摻假比例進行線性擬合分析，其相關系數大于0.99，該方法的檢出限可達1%。另一研究方向是絕對定量法，可直接測定食品中蛋白質的含量。Montowska等[19]提出了一種通過同位素內標法定量雞、鴨、鵝、豬、牛、大豆、牛奶和蛋清的專屬性多肽折算其中的蛋白含量。上述定量方法的原理均是物種含量與其含有的蛋白及多肽呈正相關，通過測定其中多肽含量推算其中物種的含量，因此，篩選用于物種定量分析的多肽是整個實驗的關鍵因素。由于高分辨質譜分辨率高，質量數可精確至小數點后四位，可用于分析鑒別物種蛋白及多肽，但同時得到的譜圖具有高緯度、高噪聲、高復雜度等特征，且每個物種得到的多肽數量眾多，因此需要有相關的專業技術方法從復雜數據中提取出有價值的信息，便于后期的實驗驗證。

近年來，多元數據統計方法已廣泛用于代謝組學和蛋白質組學分析[20]，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）統計方法，這些方法可通過減少數據維數，有效地解決樣本少、自變量多、相關性高的數據分析。Yang Jinhui等[4]使用PCA方法分析了不同比例的摻假牛奶，通過建立模型，可以準確地將樣品結果與模型進行匹配。Yuswan等[21]使用PCA方法建立了豬、牛、雞的模型，能夠準確區分這3 個物種，并使用OPLS-DA用于區分和增強模型的解釋性。Du Lijuan等[22]分別使用PCA、PLS-DA和支持向量機3種統計方法區別摻假牛奶與純牛奶。

本研究采用多元統計分析建立一種可用于篩選物種定量分析多肽的研究方法，將牛排作為研究對象，用高分辨率質譜分析不同比例的摻假牛排，并建立多變量統計分析模型，用于篩選豬、牛差異顯著性的定量多肽，根據定量多肽含量區分摻假牛排中的牛肉和豬肉含量，旨在為摻假定量分析提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛肉、豬肉購于屠宰場；市購商業牛排樣品于－18 ℃冷凍保存。

胰蛋白酶（測序級）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（生化級） 美國Promega公司；甲酸（formic acid，FA）、乙酸、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（均為生化級） 美國Sigma公司；尿素、硫脲、鹽酸（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Q Exactive HF-X液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜系統（配有電噴霧離子源） 美國Thermo公司；HENGAO T&D固相萃取裝置 美國Agilent公司；CR21N高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；HGC-24A氮吹儀 天津市恒奧科技發展有限公司；HLB固相萃取柱 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

生牛肉、豬肉樣品分別剔除脂肪、筋膜后攪碎均勻，按照市場中冷凍牛排的制作工藝，制備10種含不同比例牛肉、豬肉的牛排制品，并加入大豆蛋白粉、鹽、水、磷酸鹽等其他添加劑，委托工廠生產模擬牛排，其中，豬肉和牛肉的比例如表1所示。

表1 模擬牛排中牛肉和豬肉的混合比例Table 1 Mixing ratio between beef and pork content in simulated steak%

1.3.2 樣品前處理

采用的樣品前處理過程與相關文獻[23]方法相似。準確稱取2 g樣品，加入20 mL提取溶液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0））在冰水浴條件下采用均質方法提取蛋白質，12 000 r/min離心20 min后，準確移取200 μL上清液于小離心管中，加入30 μL DTT（50 mmol/L）溶液在56 ℃反應1 h，待冷卻至室溫后，加入30 μL IAA（100 mmol/L）溶液暗處室溫條件下反應0.5 h，再加入1.8 mL Tris-HCl（25 mmol/L，pH 8.0）、60 μL胰蛋白酶溶液（2 mg/mL）于37 ℃水浴中酶解過夜。冷卻至室溫后，用10% TFA調節pH值小于2.0以終止酶解反應，然后使用HLB固相萃取柱進行凈化，HLB萃取柱先用乙腈、50%乙腈-水、0.1% TFA進行活化，上樣，再分別用0.1% TFA、0.5%乙酸淋洗，最后用2 mL乙腈-0.5%乙酸（60∶40，V/V）洗脫，收集洗脫液，混勻后過0.22 μm濾膜，準備上機測定。每個樣品進行4 次平行實驗。

1.3.3 數據采集

利用高分辨質譜進行多肽鑒定及定量分析，色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），流速為0.2 mL/min，流動相A為0.1%甲酸-H2O，流動相B為0.1%甲酸-乙腈，梯度條件如下：0～0.2 min，97%～90% A，3%～10% B；15.8 min，60% A，40% B；16.8 min，20% A，80% B；17.3 min，20% A，80% B；18.3 min，20% A，80% B，18.5 min，97% A，3% B；25 min，97% A，3% B。進樣體積為5 μL。

質譜參數如下：噴霧電壓3 400 V，毛細管溫度320 ℃，鞘氣40 arb，輔助氣15 arb，全掃描分辨率120 000，質量掃描范圍m/z350～2 000，自動增益值為3×106，注入時間為100 ms，二級掃描，topN為10，分辨率為30 000，自動增益值為2×105，注入時間為50 ms，碰撞能量為30 V。

1.4 數據處理

高分辨質譜對數據進行采集后，利用Proteome Discoverer（PD）軟件進行數據處理，通過搜索Uniprot數據庫，對物種蛋白及多肽進行鑒定分析。PD軟件分析包括2 個工作流程：Processing Step和Consensus Step（圖1）。Processing Step涉及物種多肽的篩選及定量分析，需要從Sequest HT模塊中加入豬、牛的蛋白質數據庫，數據庫是從UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）中下載fasta文件，導入至PD軟件后進行搜索，其他參數設置為默認值即可。Consensus Step是通過增強多肽和蛋白質注釋對高可信度多肽進行過濾，經過該步驟分析后，數據可進行可視化結果展示。通過使用悟空云平臺（https://www.omicsolution.com/wkomics/main/）在線工具對PD軟件分析的數據進行PCA、PLS-DA、OPLS-DA統計分析[24]。

圖1 PD軟件分析流程圖Fig.1 Workflow of PD analysis

2 結果與分析

2.1 基于多肽組成確定牛排比例的可行性分析

2.1.1 構建PCA模型

PCA可通過正交變換將一組可能存在相關性的變量轉換為一組線性不相關的變量[25]。當樣品B10的牛肉多肽豐度設為0時，將樣品B1～B9中不同比例的牛肉多肽信息用以構建PCA模型；同樣，樣品B1的豬肉多肽豐度設為0，將樣品B2～B10中不同比例的豬肉多肽用以構建PCA模型。

如圖2a所示，具有不同牛肉含量比例的牛排樣品通過PCA可以得到有效分離，并且按照牛肉含量由大至小進行從左至右排列，牛肉含量較高的樣品主要分布在第3、4象限，而牛肉含量較低的樣品主要分布在第1、2象限。其中PC1的方差貢獻率為82.6%，表明該成分可以較好地反映原始樣品的信息；且PC1和PC2的累計方差貢獻率高達86.5%，因此該模型有望用于分析不同比例的牛肉樣品。相較而言，圖2b中不同比例豬肉含量樣品的PCA模型效果稍差。PCA圖的聚攏程度反映了樣品的相似性，即不同含量比例樣品的聚類程度。除樣品B7外，B2～B10均實現了完全分離，而樣品B7的數據之間存在較大的距離，表明此比例下的數據差異較大，聚類效果不佳。

2.1.2 構建PLS-DA模型

PLS-DA[26]是在已知樣本的分組關系時，用PLS回歸方法，在對數據降維的同時建立回歸模型，并對回歸結果進行判別分析。目前，PLS-DA已廣泛應用于蛋白質組學及代謝組學中，用以分析樣本量小、變量之間獨立性強及相關性高的樣品數據[27]。

同上述構建PCA模型的過程，分別進行不同比例豬肉和牛肉的PLS-DA。在建立的PLS-DA模型中，從圖3a（R2Y=0.124，Q2=0.092 5）和圖3b（R2Y=0.571，Q2=0.338）可以看出，各自的樣品組都得到了明顯區分，說明使用該模型分類效果顯著，組間差異明顯。尤其是圖3b中不同豬肉含量的樣品數據模型，相較于PCA，使用PLS-DA實現了更好分離。圖3中均按照樣品含量比例遞減的規律從左到右排列，并且2 個模型中，除B9外的其他組樣本均比較集中，說明組內差異較小。而B9樣品橢圓范圍最寬，樣品點分散，組內差異較大，原因可能是采用PLS-DA模型分析時，不同批次之間數據差異比較大。

圖3 不同比例的牛肉和豬肉的PLS-DA模型Fig.3 PLS-DA score plot of beef and pork mixtures in different proportions

2.1.3 構建OPLS-DA模型

OPLS-DA是在PLS-DA基礎上發展而來的算法，相較于PLS-DA，將X變量中的系統變異分解為2 部分，即同Y線性相關的部分和同Y正交的部分。隨著正交變異組分的增加，將提供更多的解釋性，并減少結果的誤差。Trygg等[28]認為，該方法可有效降低模型的復雜性并增強模型的解釋能力，但并不會降低模型的預測能力。對上述豬、牛數據進行OPLS-DA模型分析，豬的模型中的R2Y為0.401、Q2為0.139；牛模型中的R2Y為0.479、Q2為0.295。由圖4可知，豬、牛的每個混合比例的樣品組都得到了明顯區分，與PLS-DA建立的模型對比，組間間距更大，可以看出OPLS-DA模型分類效果更為顯著；并且組內之間的數據點間距較小，說明組內差異較小。表明利用高分辨鑒別的多肽中可以篩選到差異顯著性的變量以實現不同含量樣本的區分。

圖4 不同比例的牛肉和豬肉的OPLS-DA模型Fig.4 OPLS-DA score plot of beef and pork mixtures in different proportions

2.1.4 模型評價

由上述3種可視化模型圖可以得出，采用基于物種多肽響應值進行多元統計分析的方法對物種摻假量化判別可行。由上述模型的判別效果看，OPLS-DA模型的判別效果最好，因此后續數據的篩選將在OPLS-DA模型的基礎上進行。

在進行模型判別的過程中，需要關注模型的評估指標，即模型的擬合程度（R2Y）和模型的預測能力（Q2Y），從而可以識別出差異顯著性的肽段。R2Y指標的數值越接近1，表明OPLS-DA模型的數據擬合度越好[29]。

變量重要度投影（variable importance for the projection，VIP）是OPLS-DA模型中評價變量貢獻率最常用的參數，一般認為VIP值大于1的變量能夠反映統計模型中一些重要特征[30]。因此設置OPLS-DA模型中VIP值大于1，相關系數P值小于0.05，篩選出模型中差異顯著的物種多肽，其中篩選出牛多肽為257 條，豬多肽為288 條。對篩選出的多肽重新進行OPLS-DA模型擬合，如圖5所示。

圖5 篩選VIP值大于1的多肽數據繪制OPLS-DA模型Fig.5 OPLS-DA score plot of beef and pork mixtures with selected peptides based on VIP

通過刪除VIP值較小的多肽數據，新生成的OPLS-DA模型均得到了顯著改善。牛模型的R2Y為0.96，Q2Y為0.721，豬模型的R2Y為0.479，Q2Y為0.582，進一步說明該模型具有較高的擬合度和預測能力。由圖5a所示，不同比例的樣品組均能夠得到良好區分，除B3樣品較為分散外，其他樣品組均聚攏良好。相對而言，圖5b中所有樣品組均有良好的聚攏和區分。表明經過篩選后的多肽建立模型的預測能力更好，為后續篩選物種定量多肽打下基礎。

2.2 定量測定

2.2.1 差異顯著性多肽的篩選

由2.1.4節中牛OPLS-DA模型繪制S圖，圖中相關系數p1值和pcorr1值均大于0時，相應的多肽響應值與物種的含量比例呈正相關，并且值越大，其相關性越高。按數值降序的順序選擇前10%的多肽，詳細信息如表2所示。表2中選擇的25 條牛肉多肽主要來源于肌聯蛋白、肌球蛋白結合蛋白C、α-1,4-葡聚糖磷酸化酶、L-乳酸脫氫酶A鏈、肌球蛋白。同樣，也選擇了豬的25 條差異顯著性多肽，信息列于表3。這些多肽主要來自肌球蛋白、血清白蛋白、肌球蛋白結合蛋白C、α-1,4-葡聚糖磷酸化酶和鈣轉運ATP酶。這些蛋白大多數是高豐度蛋白質，具有較多數量的特異性多肽，如牛的肌聯蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白結合蛋白C，豬的肌球蛋白結合蛋白C、α-1,4-葡聚糖磷酸化酶。

表2 牛顯著性多肽信息Table 2 Selected significantly differential beef peptides

表3 豬顯著性多肽信息Table 3 Selected significantly differential pork peptides

目前，已有采用上述來源蛋白中的多肽進行物種定性鑒別的研究，如采用血清白蛋白和L-乳酸脫氫酶A中的多肽進行物種鑒別[12,23]。Ruiz等[31]從肌紅蛋白、肌球蛋白1和肌球蛋白2中篩選物種特異性多肽用以摻假鑒別。由此也進一步證實通過OPLS-DA模型篩選的物種多肽及蛋白可靠且有效。

2.2.2 差異顯著性多肽的線性方程分析及應用

對上述篩選的豬、牛的差異顯著性多肽進行線性擬合分析，以肉的含量為橫坐標，多肽的響應值為縱坐標，繪制標準曲線。其中牛多肽中有10 條多肽呈現良好的線性關系即R2大于0.99，豬源多肽中有6 條呈現良好的線性關系，如表4所示。

表4 篩選多肽的線性擬合信息Table 4 Linear equations based on the selected peptides

表5 牛排樣品中牛肉含量的測定結果Table 5 Determination of beef contents in real steak samples

圖6 牛排樣品回收率分布圖Fig.6 Distribution of recoveries of beef in real steak samples

本研究旨在提供一種快速篩選用于定量分析多肽的方法，因此僅查詢了豬、牛的數據庫并篩選了差異顯著性多肽，并未對篩選多肽的物種專屬性進一步篩查。通過對比測定牛排樣品中牛肉含量的結果，發現不同多肽測定結果并不相同，這可能是由于不同加工工藝或是添加的輔料使蛋白質產生了不同程度的變性，從而影響了酶解過程中多肽的響應值，并且本實驗是通過高分辨質譜進行定量分析，相對而言，液相色譜-三重串聯四極桿質譜的多反應監測模式具有強大的抗干擾能力及準確的定量特性[32]，因此后期實驗會針對篩選的差異顯著性定量多肽進行進一步物種唯一性分析，并使用液相色譜-三重串聯四極桿質譜進行樣品檢測，篩選回收率好的物種專屬性多肽進行日常樣品定量分析。

3 結 論

本研究通過對牛排中的豬、牛多肽數據進行統計計量學分析，分別采用PCA、PLS-DA、OPLS-DA 3種模型驗證牛排中豬肉、牛肉含量的可行性，結果顯示，3種模型均能夠實現不同含量樣品之間的區分，其中通過結合參數VIP值大于1篩選的多肽數據建立的OPLS-DA模型效果最好。利用該模型分別篩選出25 條差異顯著的牛、豬多肽，其中10 條牛多肽和6 條豬多肽得到的線性擬合結果較好，其線性相關系數R2均大于0.99，并開展了真實樣品的驗證，可以測定分析牛排中豬肉、牛肉的含量比例，實現定量分析。本研究為食品的定量分析及判別提供了一種新的多肽篩選思路。