基于氧化石墨烯的熒光適配體傳感器檢測食品中真菌毒素

王 琦，楊慶利，吳 薇

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

真菌毒素是真菌產生的一種低分子質量的天然次生代謝產物，對人和動物具有很強的毒性，其毒性主要表現在肝、腎損害、致畸、致癌、致突變等方面[1-3]。在玉米、花生等常見農作物種植、生長、收獲、運輸、存儲以及加工的各個環節都有可能受到真菌毒素的污染，這不僅會降低作物產量和品質，還會造成重大的經濟損失[4-5]。真菌毒素廣泛存在于世界范圍內，已經成為世界性關注問題[6-8]。黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）和伏馬毒素B1（fumonisin B1，FB1）是兩種比較常見的真菌毒素，主要存在于玉米、花生以及小麥等農作物及其產品中，尤其是水分含量高的環境中更容易產生。迄今為止，AFB1和FB1傳統檢測方法主要有儀器檢測法和免疫檢測法。儀器檢測法主要有薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳等，免疫檢測法常用的是酶聯免疫吸附法和熒光免疫分析法[9-12]。這些檢測方法雖然在目前階段運用比較成熟，但是由于存在樣品前處理復雜、檢測時間長、設備昂貴而造成檢測成本高、穩定性差以及不適用于現場檢測等缺點而面臨著巨大的挑戰。此外，食物和動物飼料很有可能同時受到多種真菌毒素的污染。然而，單一的檢測模式并不能提供對食品的全面監控。因此，有必要加強食品和飼料中真菌毒素的同時檢測技術。此外，開發一種新型、省時、低成本、靈敏的同時檢測真菌毒素的生物傳感器十分必要。

適配體（aptamer，APT）是通過體外指數富集配體系統進化技術從核酸隨機文庫中篩選出來的短寡核苷酸序列[13-16]。APT的堿基序列、核苷酸序列長度和環境條件構成了它獨特的三維立體結構[17]，這使其擁有特殊的結合位點，并對靶標具有較高的特異性和親和力。與抗體相比，APT具有可以大量體外合成、容易修飾、穩定性高等優點。近幾年，基于APT的生物傳感器成為研究熱點，廣泛應用于臨床醫學、化學分析、食品危害物檢測等領域[18-19]。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化產物，具有大量含氧官能團，有很好的親水性和生物相容性。相比于其他猝滅劑，GO具有更優越的熒光猝滅性能[20-21]，常常在熒光共振能量轉移系統中作為熒光受體。基于GO的熒光傳感器已廣泛應用于金屬離子、細胞、蛋白質、病原體、真菌毒素、DNA等小分子的檢測[22-27]。此外，由于π-π堆積作用GO對單鏈DNA的吸附能力強于對雙鏈DNA和G-四聯體的吸附能力，這一特性為本研究的熒光開關檢測系統提供了理論基礎。

本實驗設計一種基于GO為猝滅劑的熒光APT傳感器，熒光基團作為熒光供體，GO作為熒光受體，成功用于食品中真菌毒素（AFB1和FB1）的同時熒光檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒 市購。

GO 先鋒納米材料科技有限公司；甲醇（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；所有實驗均采用超純水（18.25 MΩ·cm）；AFB1、FB1青島普瑞邦生物工程有限公司；AFB1適配體（APT1）和FB1適配體（APT2）的寡核苷酸序列參照文獻[28-29]獲得，熒光染料（Alexa Fluor 488和Cy3）修飾在DNA探針的5’端，APT由生工生物工程（上海）股份有限公司（中國）合成。APT1和APT2的寡核苷酸序列如表1所示。

表1 APT的寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotides used in this study

1.2 儀器與設備

F-2700熒光分光光度計 日本日立有限公司；SPM-9700型原子力顯微鏡 日本島津有限公司；Trobot聚合酶鏈式反應（polymerase chain reactio，PCR）儀德國Biometra公司；3K15離心機 美國Beckman公司；KH5200E超聲清洗儀 昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光APT傳感器的構建

在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（含NaCl 136.89 mmol/L，KCl 2.67 mmol/L，Na2HPO48.1 mmol/L，KH2PO41.76 mmol/L，pH 7.4）中將APT的凍干粉稀釋至工作濃度（10 μmol/L），PCR處理后形成直鏈；將GO納米片超聲20 min，5 000 r/min離心10 min，除去沉淀，取上清液備用。然后，將30 μL GO納米片（250 μg/mL）分別與4 μL APT1&2在室溫下均勻混合5 min，形成GO-熒光APT傳感器。

1.3.2 AFB1和FB1檢測

將10 μL不同質量濃度的AFB1和FB1滴入GO-適體混合溶液中，加入PBS使最終體積達到1 mL，使AFB1和FB1終質量濃度為0、1、5、10、50、100、500 ng/mL。最終液體在一定溫度下孵育1 h。整個實驗需要在黑暗的環境下進行。最后用熒光分光光度計測量熒光強度，工作條件為狹縫寬度5 nm，電壓700 V，APT1激發波長499 nm，APT2激發波長512 nm。將水浴中孵育后的樣品（GO、GO-APT1&2、GO-APT1&2-AFB1&FB1）8 500 r/min離心10 min以獲得GO納米片。然后用超純水將GO納米片稀釋至適當質量濃度（5 μg/mL），超聲分散10 min，用原子力顯微鏡的相位模式掃描高度圖像。每個樣本平行掃描3 次。

1.3.3 溫度優化

探究溫度（30、35、40、45 ℃和50 ℃）對熒光APT傳感器檢測效果的影響。每組實驗除溫度不同外，其他操作均與1.3.2節相同。

1.3.4 實際樣品檢測

為驗證基于GO的熒光APT傳感器的實用性，采用白酒樣品[30]進行測試。首先，將1 mL白酒樣品用PBS稀釋20 倍，將溶液調至pH 7.4。然后，將已知質量濃度的AFB1和FB1加入預處理樣品中。根據1.3.2節操作，用熒光傳感器對白酒樣品進行靶標的定量檢測。

2 結果與分析

2.1 基于GO的熒光APT傳感器實驗原理

依賴于APT的識別能力、GO的熒光猝滅和ssDNA吸附能力，本研究構建了基于GO的熒光APT傳感器。圖1顯示了基于開啟式熒光APT傳感器同時檢測兩種真菌毒素（AFB1和FB1）的原理圖。由于GO表面含有含氧官能團和共軛結構，可以通過氫鍵、π-π堆積作用將APT1和APT2吸附到GO表面。伴隨著GO與APT之間的距離被拉近，APT的熒光因為熒光共振能量轉移原理會被GO猝滅，因此APT和GO組裝形成熒光APT傳感器。在溶液中沒有AFB1和FB1的情況下，真菌毒素同時檢測系統的熒光處于關閉狀態。當靶標加入時，由于APT與靶標的特異性高于GO-APT[31]，APT1、APT2更傾向于與它們的特定靶標結合在一起，從GO表面游離出來，導致熒光共振能量轉移原理被破壞，從而使APT1和APT2的熒光恢復。此時，真菌毒素同時檢測系統處于熒光開啟狀態。相應地，隨著加入的靶標濃度越來越大，熒光強度恢復值也隨之逐漸變大。

圖1 基于GO熒光的APT傳感器檢測AFB1和FB1的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of fluorescence aptasensor based on GO for detection of AFB1 and FB1

2.2 驗證實驗的可行性

圖2A顯示了APT1&2、GO-APT1&2和GO-APT1&2-靶標1&2的熒光強度之間的關系。當溶液中只有APT1&2時，熒光強度表示熒光基團的熒光（圖2A藍色曲線）。當熒光APT1&2與GO一起孵育時，熒光強度急劇下降（圖2A灰色曲線）。結果表明，由于GO的吸附作用產生了熒光共振能量轉移效應，GO成功猝滅了APT1&2的熒光。當靶標出現在溶液中時，APT1&2和特異性靶標間的高親和力使得APT優先與特異性靶標識別結合并從GO表面釋放，恢復APT1&2的顯著熒光信號（圖2A紅色曲線）。

用原子力顯微鏡測試原理設計的準確性。用原子力顯微鏡對GO的高度軌跡進行掃描。如圖2B所示，GO片的平均高度約為（1.28±0.01）nm，這個結果與GO是單原子層的理論一致。GO-APT1&2復合物的高度為（2.19±0.007）nm，厚度的增加說明APT1&2被成功地吸附在GO表面。當GO-APT1&2復合物與靶標孵育時，其厚度顯著降低至（1.65±0.025）nm。這一現象證實了適體從GO表面釋放出來，因為APT和靶標的相互作用力大于GO和APT的相互作用力。以上兩種方法均證明了實驗設計的正確性。

圖2 APT傳感器檢測的熒光光譜圖（A）和原子力顯微鏡圖像（B）Fig.2 Fluorescence emission spectra (A) and AFM images (B) of aptasensor

2.3 實驗溫度條件的優化

在室溫下，向GO-APT中加入10 μL的AFB1和FB1（50 ng/mL）后熒光強度沒有明顯恢復。為提高加入靶標后的熒光恢復效率，采取溫度優化措施。隨著孵育溫度的升高，GO與APT的相互作用減弱，APT從GO表面上釋放出來。因此，提高溫度是增強熒光恢復的理想方法。同時，過高的溫度會破壞APT與靶標之間的結合。如圖3所示，當無AFB1和FB1時，熒光強度恢復通常隨溫度的升高而增加。這一現象證實了先前的理論，即高溫促進了APT從GO表面的釋放。然而，在GO-APT1&2復合物中加入靶標時，這種現象不同。添加AFB1和FB1時，熒光信號在45 ℃以下呈現有規律地增加，但當溫度超過45 ℃時，熒光強度恢復減弱。因此，45 ℃是熒光強度恢復的臨界點。

圖3 AFB1（A）和FB1（B）檢測溫度的優化Fig.3 Optimization of detection temperatures for AFB1 (A) and FB1 (B)

2.4 APT傳感器靈敏性分析

為了證明開啟式熒光APT傳感器的靈敏度，將不同質量濃度（0、0.1、0.5、1、5、10、50、100 、500 ng/mL）的靶標（AFB1和FB1）與GO-APT1&2復合物孵育。如圖4所示，隨著AFB1和FB1質量濃度的增加，在340 nm左右GO-APT1混合溶液的熒光強度從30.23增加到340.21，在560 nm左右GO-APT2混合溶液的熒光強度從30.58增加到243.09。AFB1的回歸方程為y=82.516x＋99.599（x為lgCAFB1），R2=0.988 0（圖4A），檢出限為0.15 ng/mL。FB1的回歸方程為y=58.131x＋85.87（x為lgCFB1），R2=0.989 9，檢出限為0.12 ng/mL（圖4B）。該熒光APT傳感器可以實現對AFB1和FB1的靈敏性檢測（表2），并且具有較寬的檢測范圍。

圖4 熒光強度與靶標質量濃度的關系Fig.4 Relationship between fluorescence intensity and target concentration

表2 本研究APT傳感器與其他方法的比較Table 2 Comparison of the aptasensor with other detection methods

2.5 APT傳感器特異性分析

利用其他可能的干擾真菌毒素，如玉米赤酶烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）和棒曲霉素（Patulin），進一步檢查APT傳感器的特異性。分別向GO-APT1&2復合物中加入質量濃度為10 ng/mL的AFB1、FB1、ZEN、OTA、AFM1和Patulin。如圖5所示，干擾真菌毒素的熒光恢復值無明顯增加，而AFB1和FB1的熒光恢復值明顯，其中，AFB1的熒光恢復值是其他干擾毒素的6 倍左右，而FB1的熒光恢復值是其他干擾毒素的4 倍左右。結果表明，該熒光APT傳感器對AFB1和FB1具有很高的特異性。

圖5 APT傳感器特異性評估Fig.5 Selectivity assessment of the aptasensor

2.6 白酒樣品的檢測結果

用熒光APT傳感器檢測具有3種不同質量濃度AFB1和FB1的白酒樣品。利用加標回收實驗對實際樣品的回收率進行進一步的可靠性評價。用上述方法測定AFB1和FB1的質量濃度，并用線性方程計算。如表3所示，回收率AFB1為92.00%～100.81%，FB1為89.00%～99.50%。該方法可同時檢測真實食品樣品中的AFB1和FB1。

表3 白酒樣品中不同質量濃度AFB1和FB1的檢測Table 3 Recoveries of AFB1 and FB1 from Chinese Baijiu samples at different spiked levels

3 結 論

利用熒光共振能量轉移原理，設計一種以GO為熒光猝滅劑的熒光APT傳感器用于食品中真菌毒素AFB1和FB1的同時檢測。在最佳檢測條件下，該熒光傳感器對AFB1檢測范圍為0.1～500 ng/mL，檢出限為0.15 ng/mL，對FB1檢測范圍為0.1～500 ng/mL，檢出限為0.12 ng/mL，并且APT傳感器對靶標具有很高的特異性。在實際樣品的回收實驗中表現出良好的回收率，AFB1回收率為92.00%～100.81%，FB1回收率為89.00%～99.50%。本實驗構建快速高效的AFB1和FB1同時檢測傳感平臺，為真菌毒素以及其他小分子靶標的檢測提供了新的模型，適用于現場多重檢測，在食品和飼料安全監測中具有廣泛的應用價值。