一種5 重real-time PCR篩查轉基因水稻方法的建立

董立明，楊 帆，邢珍娟，李蔥蔥，閆 偉，龍麗坤，李飛武

（吉林省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，吉林 長春 130033）

隨著轉基因技術在農業領域的廣泛應用，轉基因作物的研發和產業化迅猛發展[1]。根據國際農業生物技術應用服務組織發布的統計數據，2018年全球26 個國家種植轉基因作物，種植面積達1.917億 公頃[2]。雖然轉基因作物在品種抗性、營養改良等方面表現優良，但其安全性問題引起了公眾的廣泛關注[3-4]。為此世界上許多國家和地區相繼建立了轉基因產品標識制度，對其進行監管，轉基因檢測技術作為監管的手段已成為研究的重點[5]。

目前，轉基因產品檢測技術主要基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術開展[6]。如普通PCR法[7]、多重PCR法[8-9]、實時聚合酶鏈式反應（realtime polymerase chain reaction，real-time PCR）法[10-11]、數字PCR法[12-14]等，同時也有一些等溫擴增技術用于轉基因的檢測，如環介導等溫擴增反應、重組酶聚合酶擴增[15-16]等。隨著商品化種植的轉基因作物品系逐年增多，傳統的單重PCR方法越來越難以滿足實際檢測的需要，研制精準、快速、高通量的檢測方法已成為轉基因檢測技術的發展趨勢[17]。多重real-time PCR是將多對引物和不同熒光標記的TaqMan探針放入一個反應體系中，一次性檢測多個靶標的方法，不僅能節省樣品和試劑，同時也能大大縮短檢測時間，實現一管多檢的高效率。此方法在微生物和病毒的檢測中已廣泛應用[18-21]，在轉基因檢測方面，也有一些報道，Wang Fengjun等[22]建立了能同時檢測Rbcl、CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTII四個基因的4 重real-time PCR方法；Niu Chenqi等[23]利用多重real-time PCR結合數字PCR建立了同時檢測CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTII、PAT及Adh1的5 重real-time PCR檢測方法；Cottenet等[24]開發了同時檢測6種外源基因和6種轉化事件的2 個多重real-time PCR檢測方法；Dong Liming等[25]建立了同時檢測內源基因Lectin和7種轉基因大豆的2 個多重real-time PCR方法。

根據國內外相關數據庫的統計信息，目前已知的轉基因作物中70%以上使用了CaMV35S啟動子，60%以上使用了NOS終止子，至少含有兩者之一的轉基因作物種類占全部轉基因作物的85%以上[26]。此外，通過對已知轉基因水稻轉化體的序列分析發現，Cry1Ab/Ac基因、HPT基因是轉基因水稻中應用最廣泛的目的基因。因此，選擇這4種基因元件作為轉基因成分篩選檢測的靶標對象，具有很好的代表性。本研究以轉基因水稻KF6號為材料，建立水稻中的CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS基因的5 重real-time PCR方法。該方法將5 個靶標進行不同的熒光標記，根據不同熒光通道的擴增曲線，準確識別測試樣品中的轉基因成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用材料見表1，以轉基因水稻KF6號為陽性對照，非轉基因水稻為陰性對照，其他轉基因玉米、大豆、水稻、棉花、油菜等材料用于特異性、適用性測試，以上樣品均由本實驗室收集保存。

表1 用于測試的轉基因樣品匯總Table 1 Genetically modified crop samples tested in this study

植物基因組提取試劑盒 德國Qiagen公司；HR qPCR Master Mix 上海輝睿生物科技有限公司；檢測引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化。

1.2 儀器與設備

ND8000紫外-可見光分光光度計 美國Thermo Fisher公司；CFX96實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；5424高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品基因組DNA提取

將所有樣品研磨成粉末，按照Qiagen試劑盒使用說明書，提取全部實驗樣品的基因組DNA，用分光光度計測量DNA的質量和濃度，用1×TE溶液將樣品DNA稀釋至25 ng/μL，4 ℃冷藏保存備用。

1.3.2 引物篩選

通過查詢網絡數據庫、國內外專利、科技論文等方式，獲得已報道的CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT及SPS基因real-time PCR檢測方法的引物序列，經引物配對篩選，確定本研究所需的引物和探針信息（表2）。用滅菌超純水將引物和探針干粉溶解至20 μmol/L，－20 ℃保存備用。

表2 5重real-time PCR體系引物/探針信息Table 2 Information about primers used for pentaplex real-time PCR system

1.3.3 5重real-time PCR體系反應條件優化

針對5 重real-time PCR體系的引物/探針終濃度、退火溫度、反應循環數等重要影響因素，優化實驗設計如表3所示。第1步，采用real-time PCR國標方法中通用的退火溫度和反應循環數，對反應體系中各靶標的引物/探針終濃度進行優化，每個靶標的正反引物用量相等，探針用量為引物的一半。第2步，使用篩選出的引物/探針終濃度，采用正交試驗的方式，對退火溫度和反應循環數進行優化。最終篩選出5 重real-time PCR的最佳反應條件。

表3 5重real-time PCR條件優化Table 3 Optimization of reaction conditions for pentaplex real-time PCR system

1.3.4 5重real-time PCR和單一real-time PCR擴增體系及程序

5 重real-time PCR體系：HR qPCR Master Mix 12.5 μL，引物和探針預混液5.625 μL，DNA模板2.0 μL，加超純水至25 μL。

單一real-time PCR體系：HR qPCR Master Mix 12.5 μL，正反引物各0.5 μL，探針0.25 μL，DNA模板2.0 μL，加超純水至25 μL。

5 重real-time PCR和單一real-time PCR的擴增程序：第1階段95 ℃變性5 min；第2階段95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共進行45 個循環；在第2階段的退火延伸（60 ℃）時段收集熒光信號。

1.3.5 5重real-time PCR體系特異性驗證

以7種常見轉基因水稻和非轉基因水稻的基因組DNA為模板，進行5 重real-time PCR體系的擴增，每個樣品3 個平行，驗證5 重real-time PCR檢測體系的特異性。

1.3.6 5重real-time PCR體系靈敏度測試

用0.1×TE稀釋陽性對照樣品的DNA，制備一系列濃度梯度的靈敏度測試樣品，進行5 重real-time PCR擴增，每個樣品3 個平行，確定5 重real-time PCR體系的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 5 重real-time PCR條件的優化

為實現在同一管中同時檢測5 個靶標，調整反應體系和反應程序是關鍵。以10 ng的轉基因水稻KF6號基因組DNA為模板，分別對5 重real-time PCR體系中的引物/探針終濃度、退火溫度及循環數的設置處理（表3）進行測試。結果顯示：在引物/探針終濃度測試中，當5 重real-time PCR體系中SPS基因、CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因的引物終濃度為0.4、0.3、0.4、0.3、0.4 μmol/L時，5 個靶標均能獲得典型擴增曲線，且曲線的熒光值最接近和Ct值差異最小；在退火溫度與擴增循環數的正交試驗中，當退火溫度為60 ℃，擴增45 個循環時，各靶標均能獲得最佳的擴增結果（圖1）。依據以上測試結果，確定了1.3.4節5 重real-time PCR檢測方法的反應體系和反應程序。

圖1 5重real-time PCR檢測體系的擴增曲線Fig.1 Amplification curves of pentaplex real-time PCR system

2.2 5 重real-time PCR體系的特異性驗證結果

為實現水稻中轉基因成分的篩查，選擇轉基因水稻KF6號、KF2號、TT51-1、M12、KMD、TIC-19、T2A-1以及非轉基因水稻等樣品，測試5 重real-time PCR體系的特異性。如表4所示，非轉基因水稻樣品僅獲得SPS基因的典型擴增曲線，無其他靶標擴增；其他轉基因水稻樣品不但擴增到SPS基因，還獲得了各自包含相應靶標的擴增曲線。所有測試樣品的擴增結果與材料本身所包含的篩選元件和目的基因一致[32]，無假陰性結果和非特異性擴增的情況出現，表明建立的5 重real-time PCR體系可特異性用于包含以上5種元件的轉基因水稻的檢測，可對目前已知的轉基因水稻進行高效篩查。

表4 5重real-time PCR特異性驗證Table 4 Specificity validation of pentaplex real-time PCR system

2.3 5 重real-time PCR體系的靈敏度測試結果

將KF6號的DNA進行一系列梯度稀釋，獲得每種靶標質量分數分別為100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.016%、0.008%的8 個DNA樣品，開展靈敏度測試。如圖2所示，當靶標質量分數為100%～0.032%時，所有5 個靶標均能擴增到典型擴增曲線（Ct值在23.82～37.93之間），且依據以上稀釋濃度建立的標準曲線具有很好的線性關系（斜率范圍－3.162～－3.356，相關系數R2范圍0.997～0.999，擴增效率范圍98.3%～106.1%）；當靶標質量分數在0.016%及以下時，雖CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT四個靶標能夠穩定擴增，但SPS基因擴增不穩定，經常存在平行實驗不能穩定擴增的情況。表明本方法的檢測靈敏度可達到0.032%。

圖2 5重real-time PCR檢測體系的靈敏度測試Fig.2 Sensitivity testing of pentaplex real-time PCR system

2.4 5 重real-time PCR與單一real-time PCR的檢測能力比較

用單一real-time PCR擴增上述濃度梯度的稀釋樣品，驗證5 重real-time PCR體系的檢測靈敏度水平。結果見圖3，CaMV35S啟動子在單一real-time PCR與5 重realtime PCR中的擴增效率分別為105.1%和103.6%，R2均為0.999（圖3A）；NOS終止子的擴增效率分別為98.4%和100.7%，相關系數分別為0.998和0.999（圖3B）；Cry1Ab/Ac的擴增效率分別為106.1%和105.2%，相關系數分別為0.998和0.999（圖3C）；HPT的擴增效率分別為101.9%和98.3%，相關系數分別為0.999和0.997（圖3D），SPS的擴增效率分別為102.8%和106.5%，相關系數分別為0.996和0.999（圖3E），說明從擴增效率和R2等方面比較，在100%～0.032%的靶標質量分數范圍內，單一real-time PCR與5 重real-time PCR無明顯差別，兩種方法具有同等的穩定性和檢測能力。表明本研究建立的5 重real-time PCR方法靈敏度高、穩定性好，適用于水稻中轉基因成分的高靈敏度檢測。

圖3 5重real-time PCR與單一real-time PCR的檢測能力比較Fig.3 Comparison of detection performance between pentaplex real-time PCR and single real-time PCR

2.5 5 重real-time PCR體系在其他轉基因作物篩查中的應用

在5 個篩選靶標中，SPS作為內源基因僅存在于水稻樣品中，其他4 個靶標CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT被廣泛應用于玉米、大豆、棉花、油菜等轉基因作物中。因此本研究選擇30種常見的轉基因原材料，驗證5 重real-time PCR體系在其他轉基因作物篩查中的適用性。如表5所示，測試樣品的擴增結果與預期基本吻合，僅在MON810、Bt176玉米中未檢測出預期的Cry1Ab基因，這可能是因為本研究所采用的Cry1Ab/Ac基因引物序列與上述2 個樣品的Cry1Ab基因相應序列存在多個堿基不匹配。總體而言，利用本研究建立的5 重real-time PCR體系，可從30種測試轉基因材料中檢測出相應的轉基因成分，表明此方法不僅適用于水稻中轉基因成分的檢測，也可對其他轉基因作物進行篩查。

表5 5重real-time PCR適用性測試Table 5 Applicability of pentaplex real-time PCR system

3 討論與結論

CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因是當前商業化應用的轉基因作物中最常見的外源基因，也是轉基因產品分子檢測最常用的篩查元件。在日常檢測工作中，一般采用先篩查常見外源元件，然后再鑒定轉化事件的方式，確定待檢樣品是否為轉基因產品及含有的轉基因身份。為了提高檢測通量和效率，國內外學者采用多重PCR策略，以實現在同一管中一次檢測多個靶標。其中，多重real-time PCR以操作簡單、耗時時間短、可有效避免氣溶膠污染等優點被廣泛應用。在實際應用中，不同靶標的引物/探針濃度配比、退火溫度、擴增循環數都會對多重real-time PCR擴增效果產生影響。針對上述影響因素，本實驗均設置多個處理，進行大量的篩選，最終建立了5 重real-time PCR方法。

與前期已發表的轉基因水稻多重real-time PCR檢測方法相比，本研究的優點在于，通過分析國內外已批準的轉基因水稻中的外源基因元件，選擇其中最常見的4種及水稻內源基因，建立了5 重real-time PCR體系，實現了對常見基因水稻的全覆蓋篩選檢測。Gu Shaobin等[33]建立的轉基因水稻多重real-time PCR方法以CaMV35S啟動子和水稻內標基因SPS為標靶，對樣品中的轉基因成分進行定量檢測。張明哲等[1]建立的復合PCR熒光檢測方法是經復合PCR擴增和毛細管電泳熒光檢測，實現對4種轉基因水稻品系的檢測。而本研究建立的方法是為了快速測定樣品中是否含有轉基因成分，實現的目標不同。在轉基因檢測的實際工作中，將本研究的篩選方法與轉化體特異性檢測方法結合使用，則即可實現篩選檢測，又能實現身份鑒定。

本研究建立的5 重real-time PCR特異性好，靈敏度可達單一real-time PCR水平，并且具有很好的適用性，能對國內外已批準的常見轉基因水稻進行初步篩查檢測，還可對常見轉基因玉米、大豆、棉花和油菜進行篩查。此方法的研發，為轉基因水稻監管和篩查提供了一種高效的技術手段。