白玉菇中鮮味肽的分離鑒定及呈味特性分析

李曉明，黃占旺，徐明生，沈勇根，盧劍青，劉馥源，程宏楨，安兆祥，徐 弦

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省發(fā)展與改革委員會(huì)農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

鮮味作為5種基本口味之一（酸、甜、苦、咸、鮮）[1]，深受人們的喜愛(ài)，這種獨(dú)特的風(fēng)味具有良好的協(xié)同性，有助于人們從食物中獲得更好的香氣及口感[2]。鮮味物質(zhì)主要包括氨基酸、核苷酸、無(wú)機(jī)鹽、多肽及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[3]，在這些物質(zhì)中，鮮味多肽因其良好的口感及加工適應(yīng)性越來(lái)越受到人們的關(guān)注。鮮味肽廣泛存在于各種食物中，研究者已經(jīng)從肉類(lèi)[4]、蔬菜[5]、海鮮[6-7]等食品中分離鑒定出上百種鮮味肽，其中最著名的鮮味肽是Yamasaki等[8]從木瓜蛋白酶牛肉水解物中分離的序列為L(zhǎng)ys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala的牛肉辛肽。除了良好的呈味性外，鮮味肽還具備一定的功能特性，林萌莉[9]通過(guò)測(cè)定中性蛋白酶與風(fēng)味酶混合酶解大豆蛋白酶解物的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率，發(fā)現(xiàn)大豆鮮味肽具有降血壓活性。鮮味肽作為一種新型鮮味劑，符合“天然、營(yíng)養(yǎng)、安全”的食品發(fā)展理念，因此人們希望從更多的食物中提取鮮味肽。

食用菌營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美在世界范圍內(nèi)廣受歡迎[10]，并且食用菌還具有一定的藥用價(jià)值，可用于預(yù)防高血壓、高膽固醇及癌癥等多種疾病[11]。食用菌是低脂高蛋白食物[12]，是制備美味鮮味肽的理想原料。Xu Xiaodong等[13]通過(guò)感官引導(dǎo)，從高壓蒸煮后的草菇中鑒定出3 條鮮味肽，即Ala-Ser-Asn-Met-Ser-Asp-Leu、Tyr-Tyr-Gly-Ser-Asn-Ser-Ala和Leu-Gln-Pro-Leu-Asn-Ala-His；Kong Yan等[14]通過(guò)連續(xù)色譜技術(shù)從香菇酶解液中純化鑒定出3 條呈味二肽和2 條呈味三肽，即Val-Phe、Cys-Met、Gly-Glu、Gly-Cys-Gly和Glu-Pro-Glu，這5 條肽對(duì)香菇的鮮味皆有重要貢獻(xiàn)。白玉菇菇體潔白，質(zhì)地細(xì)膩，食用時(shí)具有濃濃的海蟹味，故又稱海鮮菇[15]。白玉菇的蛋白質(zhì)含量豐富，占干質(zhì)量的21.8%[16]，且蛋白質(zhì)中甜鮮類(lèi)氨基酸占比較高[17]，具備制備鮮味肽的潛力。目前，人們對(duì)白玉菇的研究主要集中在多糖的提取、活性評(píng)價(jià)[18-19]及采后貯藏保鮮[20-21]方面，對(duì)白玉菇鮮味肽的分離鑒定鮮見(jiàn)報(bào)道。

超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)是科研領(lǐng)域中重要的分離鑒定方法，能夠?qū)?fù)雜物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)分析，具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。Yu Zilin等[22]運(yùn)用UPLC-MS/MS技術(shù)，從蠶蛹蛋白水解物中分離鑒定出4種鮮味肽，4種肽中不僅含有鮮味氨基酸也有苦味氨基酸；Zhuang Mingzhu等[23]采用該方法從醬油中純化鑒定出5種鮮味肽，并證實(shí)了肽在醬油鮮味中起重要作用。因此，UPLC-MS/MS能夠應(yīng)用于鮮味肽的分離鑒定。

綜上所述，本研究將采用超濾（ultrafiltration，UF）、凝膠過(guò)濾色譜（gel filtration chromatography，GFC）、反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）及UPLCMS/MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合感官評(píng)價(jià)從白玉菇水提物中純化及鑒定鮮味肽，并通過(guò)合成的純肽對(duì)白玉菇鮮味肽的鮮味特性加以驗(yàn)證。研究旨在發(fā)現(xiàn)白玉菇鮮味肽，并為白玉菇鮮味調(diào)味品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)，以提升白玉菇附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉、蔗糖、鹽、味精 市購(gòu)；新鮮白玉菇 江西星火農(nóng)林科技有限公司；合成肽 上海吉爾生化有限公司。

檸檬酸（食品級(jí)） 濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；咖啡因（食品級(jí)） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-15葡聚糖凝膠 北京索萊寶科技有限公司；三氟乙酸（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)天地公司；甲酸（色譜純），二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）（均為分析純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；MY-CD5026P電壓力鍋 美的集團(tuán)股份有限公司；3 000 Da超濾離心管 美國(guó)Millipore公司；SF-TGL-16G低溫高速離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Scientz-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀 德國(guó)Eppendorf公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器、HD-3紫外檢測(cè)儀上海滬西分析儀器廠有限公司；1525高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司；Ultimate 3000毛細(xì)管高效液相色譜儀、Q Exactive質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 白玉菇水提物的制備

新鮮白玉菇去除底部基質(zhì)，洗凈切段，按料液比1∶1（g/mL）加入蒸餾水，40 kPa高壓蒸煮2 h，雙層紗布過(guò)濾，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，收集上清液濃縮，冷凍干燥后得到白玉菇水提物，－80 ℃冷凍保存待用。

1.3.2 UF分離

許多研究通過(guò)風(fēng)味評(píng)估的方法發(fā)現(xiàn)鮮味物質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在3 000 Da以下[24-25]，所以本實(shí)驗(yàn)選取白玉菇水提物中分子質(zhì)量低于3 000 Da的樣品作為研究對(duì)象。為保護(hù)UF膜組件不被劃傷，先用0.45 μm有機(jī)濾膜對(duì)樣品溶液預(yù)過(guò)濾，然后選取截留分子質(zhì)量為3 000 Da的UF離心管，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，濾液冷凍干燥，－80 ℃冷凍保存待用。

1.3.3 GFC分離

參照Feng Tao等[26]的方法稍作修改，將分子質(zhì)量小于3 000 Da的樣品溶解于純水中，在25 ℃條件下裝載到Sephadex G-15層析柱（2.6 cm×60 cm）上進(jìn)行分離。具體色譜參數(shù)：樣品質(zhì)量濃度100 mg/mL；進(jìn)樣量5 mL；洗脫液為超純水，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。按照譜峰將分離的各個(gè)組分收集、濃縮、凍干后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.4 RP-HPLC純化

參照Dang Yali等[27]的方法稍作修改，將從GFC分離得到的鮮味最佳組分溶解于純水中，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后使用RP-HPLC系統(tǒng)進(jìn)一步分離純化。具體檢測(cè)條件：樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL；進(jìn)樣量100 μL；色譜柱為C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為0.05%三氟乙酸-乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.05%三氟乙酸-超純水溶液，VA∶VB=2∶8；等度洗脫40 min；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。按照譜峰將分離的各組分收集，凍干后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.5 UPLC-MS/MS鑒定多肽序列

1.3.5.1 樣品前處理

將RP-HPLC分離得到的鮮味最佳組分溶解于雙蒸水中，于溶液中加入適量DTT溶液，在56 ℃水浴中還原1 h，防止蛋白質(zhì)氧化變性，然后加入適量IAA溶液避光反應(yīng)40 min，中和多余的DTT。使用脫鹽柱純化多肽脫鹽，將多肽液洗脫至1.5 mL離心管中，于45 ℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑。

1.3.5.2 UPLC條件

預(yù)柱為Acclaim PepMap RPLC C18（300 μm×5 mm，5 μm，100 ?）；分析柱為Acclaim PepMap RPLC C18（150 μm×150 mm，1.9 μm，100 ?）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-2%乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-80%乙腈溶液；梯度洗脫90 min，洗脫條件：0～10 min，94%～91% A，6%～9% B；10～30 min，91%～86% A，9%～14% B；30～70 min，86%～70% A，14%～30% B；70～87 min，70%～60% A，30%～40% B；87～90 min，60%～5% A，40%～95% B；流速600 nL/min。

1.3.5.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件

肽段用樣品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解后，4 ℃、13 200 r/min離心20 min，取上清液，直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行在線檢測(cè)，具體參數(shù)如下：

一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：分辨率為70 000，自動(dòng)增益控制為3×106，離子最大注入時(shí)間40 ms，質(zhì)量掃描范圍m/z300～1 400；二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：分辨率為17 500，自動(dòng)增益控制為1×105，離子最大注入時(shí)間60 ms，從一級(jí)質(zhì)譜中選擇進(jìn)行二級(jí)碎裂的離子數(shù)為20，NCE模式碰撞能量27 eV。

對(duì)采集到的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行手動(dòng)De novo解析，獲得多肽序列的分子質(zhì)量誤差為±0.02 Da。

1.3.6 定向合成目標(biāo)肽

經(jīng)UPLC-MS/MS鑒定的多肽序列由上海吉爾生化有限公司采用Fmoc固相法[28]合成，純度在95%以上，對(duì)合成后純肽的呈味特性進(jìn)行研究。

1.3.7 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)定小組由5 男6 女共11 人組成，年齡在24～50 歲之間，具有豐富的感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)。感官評(píng)價(jià)在食品感官分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，室溫控制為（23±2）℃。

1.3.7.1 GFC各組分的感官分析及TDA

將UF凍干樣及GFC各組分溶解于1 mg/mL氯化鈉溶液中，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液供小組成員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。5種基本味覺(jué)酸、甜、苦、咸、鮮對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品分別為0.8 mg/mL檸檬酸溶液、10 mg/mL蔗糖溶液、0.8 mg/mL咖啡因溶液、3.5 mg/mL氯化鈉溶液、3.5 mg/mL味精溶液[13]，標(biāo)準(zhǔn)品的感官評(píng)分為5 分，實(shí)驗(yàn)采取10 分制，0 分表示無(wú)，10 分表示最強(qiáng)。評(píng)價(jià)人員對(duì)每個(gè)樣品的酸、甜、苦、咸、鮮進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)結(jié)果采用雷達(dá)圖標(biāo)識(shí)。

滋味稀釋分析（taste dilution analysis，TDA）是將感官分析與儀器分析相結(jié)合檢測(cè)食品中關(guān)鍵滋味活性物質(zhì)的一種有效方法[29]。將5 mg/mL的各組分溶液以體積比1∶1的比例逐步稀釋，采用三角試驗(yàn)評(píng)估每一個(gè)稀釋水平，直至評(píng)價(jià)人員無(wú)法從一份肽溶液及2 份超純水溶液中識(shí)別出肽溶液為止，記錄此時(shí)溶液的稀釋水平即為滋味稀釋（taste dilution，TD）值。

1.3.7.2 RP-HPLC各組分的感官分析

參照1.3.7.1節(jié)方法進(jìn)行感官特性分析。

1.3.7.3 合成肽的感官分析

參照1.3.7.1節(jié)方法。

1.3.7.4 合成肽的鮮味閾值及增鮮閾值測(cè)定

采用三角試驗(yàn)法[13]。合成肽溶液的起始質(zhì)量濃度為1 mg/mL，將溶液以體積比1∶1的比例逐漸稀釋，直至溶液鮮味無(wú)法識(shí)別出為止，將倒數(shù)第2個(gè)溶液的質(zhì)量濃度值記為合成肽的鮮味閾值；在0.5 mg/mL的味精溶液中添加合成肽，等比例提高溶液的合成肽質(zhì)量濃度，直至評(píng)價(jià)人員能夠從3 份溶液中準(zhǔn)確識(shí)別出添加有合成肽的溶液為止，將此時(shí)溶液的質(zhì)量濃度值記為合成肽的增鮮閾值。

1.3.7.5 合成肽的劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

參照Z(yǔ)hang Jianan等[30]的方法稍作修改，以0.5 mg/mL味精溶液為母液配制6種不同質(zhì)量濃度的合成肽溶液（0、2、4、6、8、10 mg/mL），鮮味標(biāo)準(zhǔn)品為3.5 mg/mL谷氨酸鈉溶液，感官評(píng)分為5 分，評(píng)價(jià)人員采用10 分制對(duì)合成肽溶液的鮮味進(jìn)行打分，將所有評(píng)分匯總后得到合成肽的劑量-反應(yīng)曲線。

1.3.7.6 合成肽對(duì)雞湯的味覺(jué)調(diào)節(jié)特性

將200 g雞胸肉洗凈切成2～3 cm的小塊，加入1 L水和3 g生姜，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火加熱1.5 h，冷卻至室溫后，丟棄肉塊，向雞湯中加入5 g鹽，并定容至1 L。以雞湯為母液，配制5 mg/mL合成肽和3.5 mg/mL味精溶液，評(píng)價(jià)人員采用10 分制對(duì)各溶液的鮮味、咸味和甜味進(jìn)行打分。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和Origin 2019對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，并采用Duncan新復(fù)極差法對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFC分離純化鮮味組分

2.1.1 GFC分離結(jié)果

GFC對(duì)鮮味肽具有較好的初步分離效果，現(xiàn)已被廣泛使用。GFC分離是利用分子篩原理，利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)不同分子質(zhì)量物質(zhì)分離的一種方法[31]。實(shí)驗(yàn)材料為經(jīng)UF制得的分子質(zhì)量小于3 000 Da的白玉菇鮮味組分。如圖1所示，UF組分經(jīng)GFC分離后共得到5 個(gè)組分，分別標(biāo)記為F1、F2、F3、F4、F5，保留時(shí)間為70～480 min，其中F5的保留時(shí)間最長(zhǎng)。分別收集各組分，冷凍干燥后進(jìn)行感官分析。

圖1 UF所得組分GFCFig.1 Gel filtration chromatograms ultrafiltration fractions

2.1.2 GFC分離各組分的感官特性及TDA

如圖2所示，UF和GFC組分在相同質(zhì)量濃度的氯化鈉溶液中，味道特征大體相似，其中鮮味最為強(qiáng)烈，咸味和甜味相對(duì)較強(qiáng)，苦味和酸味相對(duì)較弱。所有組分中，UF組分的味道特征濃烈，鮮味和咸味值最高；經(jīng)GFC分離后的各組分鮮味和咸味特征均弱于UF組分，其中F3的鮮味值最高，鮮味特征與UF組分接近，說(shuō)明凝膠過(guò)濾具有一定的脫鹽效果，也說(shuō)明了低鹽溶液對(duì)鮮味具有增強(qiáng)作用[32]。如圖3所示，UF組分的TD值最高，為128；GFC分離的各組分中，F(xiàn)3的TD值最高，為64，說(shuō)明F3對(duì)整體的鮮味影響最大。結(jié)合感官評(píng)價(jià)表明F3是鮮味最佳組分，選取F3進(jìn)行分離純化。

圖2 UF及GFC分離各組分感官雷達(dá)圖Fig.2 Radar map of taste profiles of UF and GFC fractions

圖3 UF及GFC分離各組分的TDA圖Fig.3 Taste dilution analysis of UF and GFC fractions

2.2 RP-HPLC分離純化F3組分

2.2.1 RP-HPLC分離結(jié)果

RP-HPLC是根據(jù)分子的疏水性強(qiáng)弱進(jìn)而將物質(zhì)洗脫分離的一項(xiàng)色譜技術(shù)，往往是多肽、蛋白等純化分離的最后一道步驟，具有操作簡(jiǎn)便、速度快、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[33]。如圖4所示，F(xiàn)3組分經(jīng)RP-HPLC分離后共得到4 個(gè)組分，分別標(biāo)記為P1、P2、P3、P4，相應(yīng)的出峰時(shí)間為4.233、5.233、5.500、6.450 min，其中P1的出峰時(shí)間最短，說(shuō)明其疏水性較弱。疏水性強(qiáng)弱與氨基酸性質(zhì)有關(guān)[34]，多數(shù)的苦味氨基酸如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸為疏水性氨基酸，多數(shù)的甜鮮味氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸為親水性氨基酸[35]，表明P1可能含有較多的甜鮮味親水性氨基酸。分別收集各組分，冷凍干燥后進(jìn)行感官分析。

圖4 F3的RP-HPLC分離色譜圖Fig.4 RP-HPLC profile of fraction F3

2.2.2 RP-HPLC分離各組分的感官特性分析

如圖5所示，經(jīng)RP-HPLC分離的4 組分鮮味特征強(qiáng)烈，在所有口味中占主導(dǎo)作用，甜味和咸味相對(duì)較弱，其次為苦味和酸味。4 組分中P1鮮味效果最佳，P2的鮮味次之，同時(shí)P1和P2也具有較高的甜味和咸味值；P3和P4的鮮味值較低，呈鮮效果較差。因此選擇P1進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，鑒定其氨基酸序列。

圖5 RP-HPLC分離各組分的感官雷達(dá)圖Fig.5 Radar map of taste profiles of RP-HPLC fractions

2.3 白玉菇鮮味肽的鑒定

UPLC-MS/MS為適用于蛋白質(zhì)和多肽研究的分離鑒定技術(shù)，具有準(zhǔn)確率高、速度快、特異性突出等優(yōu)點(diǎn)[36]。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)P1組分還原烷基化，然后對(duì)樣品脫鹽，之后采用UPLC對(duì)樣品進(jìn)行分離，分離后的多肽樣品經(jīng)電噴霧解離后以帶電母離子形式進(jìn)入高分辨率質(zhì)譜儀，母離子經(jīng)過(guò)碰撞誘導(dǎo)裂解獲得二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，形成MS/MS圖譜。多肽鍵中的酰胺鍵易于斷裂，會(huì)產(chǎn)生較多的b和y離子，同一系列內(nèi)相鄰的離子碎片之間的質(zhì)荷比差值可以反映相應(yīng)的氨基酸信息，可根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜中b和y離子碎片，對(duì)多肽氨基酸序列進(jìn)行解析[37]。

如圖6所示，鮮味組分P1經(jīng)過(guò)UPLC-MS/MS分析檢測(cè)，采用手動(dòng)De novo測(cè)序共得到6種多肽的氨基酸序列，分別為EAKVY（Glu-Ala-Lys-Val-Tyr）、ELELQ（Glu-Leu-Glu-Leu-Gln）、SLLQPL（Ser-Leu-Leu-Gln-Pro-Leu）、NYNGGY（Asn-Tyr-Asn-Gly-Gly-Tyr）、VANGGGFGAA（Val-Ala-Asn-Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-Ala-Ala）、ELQSGNTY（Glu-Leu-Gln-Ser-Gly-Asn-Thr-Tyr），分子質(zhì)量分別為608.32、630.32、669.41、686.27、819.39 Da和910.40 Da。6種多肽均含有豐富的親水性氨基酸，其中EAKVY、ELELQ、NYNGGY和ELQSGNTY的親水性氨基酸占比超過(guò)50%，表明P1組分中的多數(shù)肽具有親水性，這與RP-HPLC分離結(jié)果一致。鮮味肽的帶電基團(tuán)與疏水基團(tuán)分別與相應(yīng)的味覺(jué)感受器相連產(chǎn)生鮮味，其鮮味的產(chǎn)生不僅和鮮味肽所帶的基團(tuán)有關(guān)，也與人體的味覺(jué)受體有關(guān)，除此之外，鮮味肽的鮮味還與其分子質(zhì)量、氨基酸序列及肽鏈的構(gòu)象有關(guān)[38]，一般來(lái)說(shuō)，鮮味肽的分子質(zhì)量集中在1 000 Da以下，Rhyu等[24]研究發(fā)現(xiàn)韓國(guó)豆醬水提物中分子質(zhì)量集中在500～1 000 Da的小分子組分具有較強(qiáng)的鮮味；林萌莉等[39]通過(guò)研究雞湯中多肽與鮮味的構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)，高比例甜鮮氨基酸的組成是多肽具有鮮味的關(guān)鍵因素。甜鮮味氨基酸包括谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸[40]，白玉菇6種多肽中甜鮮氨基酸占比較高，且所有肽的分子質(zhì)量集中在608～910 Da之間，表明白玉菇多肽可能具有良好的呈鮮效果。為驗(yàn)證其鮮味特性及鮮味增強(qiáng)效果，需將其合成后進(jìn)行進(jìn)一步感官分析。

圖6 UPLC-MS/MS鑒定所得多肽的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 Primary and secondary mass spectra of peptides identified by UPLC-MS/MS

2.4 合成肽的呈味特性分析

2.4.1 合成肽的感官特性分析

如圖7所示，6種合成肽的鮮味特征突出，其次為咸味、甜味和酸味，苦味是5種基本味道中最弱的。6種合成肽中ELELQ的鮮味強(qiáng)度最高，評(píng)分為5.42 分，其次為NYNGGY（4.95 分）、ELQSGNTY（4.53 分）、EAKVY（4.11 分），鮮味相對(duì)較弱的為SLLQPL（3.72 分）、VANGGGFGAA（3.23 分）。鮮味肽的滋味豐富，往往不止一種味道[41]，如圖7所示，咸味評(píng)分中ELELQ得分也最高，為4.25 分，其次為NYNGGY（3.93 分）和ELQSGNTY（3.65 分）；甜味評(píng)分中NYNGGY的評(píng)分最高，為3.35 分，其次為ELELQ（3.28 分）、ELQSGNTY（3.00 分）。此外所有的合成肽均表現(xiàn)出一定的酸味，這是因?yàn)殡逆溨械聂然怆x強(qiáng)度大于氨基，溶液顯酸性[23]。

圖7 6種合成肽的感官雷達(dá)圖Fig.7 Radar map of taste profiles of six synthetic peptides

2.4.2 合成肽的鮮味閾值及增鮮閾值

為了進(jìn)一步確認(rèn)合成肽的鮮味特性，需對(duì)其鮮味閾值及增鮮閾值進(jìn)行確定。由表1可知，6種合成肽的鮮味閾值存在顯著差異（P＜0.05），ELELQ的鮮味閾值最低，為0.16 mg/mL；其次為ELQSGNTY（0.19 mg/mL）；SLLQPL的鮮味閾值最高，為0.63 mg/mL。同時(shí)6種肽表現(xiàn)出不同的增鮮能力，增鮮閾值差異顯著（P＜0.05），其中NYNGGY的增鮮閾值最低，在0.02 mg/mL時(shí)對(duì)0.5 mg/mL的味精溶液能起到明顯的增鮮作用；VANGGGFGAA的鮮味增強(qiáng)能力最弱，增鮮閾值最高，為0.25 mg/mL。

表1 合成肽的鮮味閾值及增鮮閾值Table 1 Umami thresholds and umami-enhancing thresholds of synthetic peptides

2.4.3 合成肽的劑量-反應(yīng)關(guān)系

劑量-反應(yīng)曲線直觀反映了鮮味模型中合成肽的釋放和消失對(duì)模型鮮味的影響[23]。從圖8可以看出，白玉菇中6種肽的增鮮曲線均呈先升高后降低的趨勢(shì)，所有合成肽的鮮味峰值皆為8 mg/mL，當(dāng)在鮮味峰值時(shí)，6種肽的鮮味增強(qiáng)能力差異顯著（P＜0.05），其中NYNGGY和ELELQ的鮮味增強(qiáng)能力突出，相比之下VANGGGFGAA的增鮮能力較弱。當(dāng)合成肽質(zhì)量濃度超過(guò)8 mg/mL后，合成肽的酸味使溶液的酸味強(qiáng)度升高，會(huì)對(duì)溶液的鮮味產(chǎn)生抑制，這表明并不是鮮味肽越多溶液的鮮味越好，鮮味肽的添加量有一定限制。

圖8 6種合成肽在味精溶液中的劑量-反應(yīng)曲線Fig.8 Dose-response curves of umami taste for six synthetic peptides in the presence of monosodium glutamate solution

2.4.4 合成肽對(duì)雞湯味覺(jué)調(diào)節(jié)特性分析

燉煮后的雞湯味道鮮美，香氣濃郁，給人最直接的味覺(jué)感受是鮮、咸和甜，因此本實(shí)驗(yàn)向雞湯中添加合成肽與味精，通過(guò)比較味精溶液與各合成肽溶液的鮮味、咸味和甜味強(qiáng)度，以進(jìn)一步確定合成肽的風(fēng)味特征。如圖9所示，添加合成肽和味精后的雞湯溶液鮮味、咸味和甜味均有不同程度的增加，其中味精只對(duì)雞湯的鮮味提升顯著（P＜0.05），對(duì)咸味和甜味的提升不顯著（P＞0.05）。Goto等[42]研究表明鮮味肽對(duì)谷氨酸鈉和氯化鈉具有協(xié)同性，可使溶液的鮮味和咸味強(qiáng)度增加。在各合成肽中，ELELQ、NYNGGY、ELQSGNTY、EAKVY表現(xiàn)出較好的鮮味增強(qiáng)能力，鮮味強(qiáng)度分別提升了49.02%、43.14%、35.29%、31.37%，但與味精溶液的鮮味強(qiáng)度差異不顯著（P＞0.05）；在咸味評(píng)價(jià)中，ELQSGNTY、ELELQ、EAKVY、NYNGGY表現(xiàn)出較好的咸味增強(qiáng)能力，咸味強(qiáng)度分別提升了33.33%、28.89%、26.67%、22.22%；合成肽對(duì)雞湯的甜味也具有明顯的提升作用，其中NYNGGY、ELELQ、ELQSGNTY、VANGGGFGAA對(duì)雞湯溶液的甜味提升顯著，甜味強(qiáng)度分別增加了40.00%、30.00%、28.00%、24.00%。綜合分析，所有合成肽對(duì)模型雞湯均具有鮮味、咸味和甜味增強(qiáng)特性，其中ELELQ、NYNGGY、ELQSGNTY的增強(qiáng)效果較好。

圖9 合成肽對(duì)雞湯的味覺(jué)調(diào)節(jié)特性Fig.9 Taste-modulating characteristics of synthetic peptides on chicken soup

3 結(jié) 論

通過(guò)UF、GFC和RP-HPLC結(jié)合感官評(píng)價(jià)引導(dǎo)，從白玉菇水提液中分離純化得到鮮味最佳組分P1，P1組分經(jīng)UPLC-MS/MS鑒定出6種甜鮮氨基酸占比較高的鮮味多肽，即EAKVY、ELELQ、SLLQPL、NYNGGY、VANGGGFGAA、ELQSGNTY，分子質(zhì)量分別為608.32、630.32、669.41、686.27、819.39、910.40 Da。

將6種多肽采用Fmoc固相合成法制備，并通過(guò)感官評(píng)價(jià)分析發(fā)現(xiàn)：從白玉菇中分離鑒定出的6種多肽既是鮮味肽也是鮮味增強(qiáng)肽，6種合成肽不僅本身具有一定的鮮味值，鮮味閾值在0.16～0.63 mg/mL之間，而且對(duì)味精溶液有增鮮作用，增鮮閾值在0.02～0.25 mg/mL之間；6種合成肽的劑量-反應(yīng)曲線均呈先升高后降低的趨勢(shì)，所有肽的鮮味峰值濃度皆為8 mg/mL，在鮮味峰值時(shí)6 條肽的增鮮能力差異顯著（P＜0.05），其中NYNGGY、ELELQ的增鮮能力突出；6種合成肽對(duì)雞湯的鮮味、咸味和甜味強(qiáng)度均具有不同程度的提升，其中鮮味提升效果最佳，但與味精相比鮮味提升效果不顯著，綜合比較得出ELELQ、NYNGGY、ELQSGNTY對(duì)雞湯的味感提升效果最佳。