發酵對山黑豬肉干品質特性的影響

周亞軍，王 寧，陳 艷，張 玉，王淑杰

（1.吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062；2.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130022）

由于傳統的飲食習慣，我國是豬肉生產和消費大國。國家統計局歷年統計數據顯示，2013—2018年我國肉總產量基本維持在8 500萬 t，其中豬肉產量占比60%以上。隨著人們健康生活意識的提高，對高品質豬肉的需求也隨之增加。但因為工廠化白豬過分要求豬的飼料轉化率、生長速率等，忽略消費者對高品質豬肉的需求。吉林山黑豬是將北京黑豬和大約克夏豬雜交育種，歷經20 年培育出的優質瘦肉型黑豬品種。與工廠白豬相比，不僅生長速度快、經濟效益好，還具有高谷氨酸、高不飽和脂肪酸、低膽固醇、風味濃郁、脂肪沉積性好等特點[1]。周慧敏等[2]研究發現與普通瘦肉型豬肉相比山黑豬肉味風味更為濃郁，己醛、辛醛等5種醛類和苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮2種酮類是形成2種豬肉風味差異的主要原因。目前山黑豬年出欄量可達20萬 頭，可部分填補國內高品質豬肉市場，深受消費者歡迎。

肉干是經過腌制、干燥等工藝加工而成的傳統肉制品，因其蛋白質含量高、易攜帶、方便貯存等特點受到人們的喜愛。肉干傳統工藝制作中會經過較長時間干燥，存在產品口感較硬、咀嚼性較差、色澤不佳等現象。添加外源發酵劑制成的發酵肉干，在微生物的作用下可以改善肉干的質地、形成獨特風味和提高消化率，還可以抑制有害微生物生長和氧化、降低亞硝酸鹽殘留量和有害生物胺含量[3-4]。目前，對吉林山黑豬研究主要集中在豬肉品質[1-2]，其發酵制品研究較少，僅張海杰[5]以山黑豬肉為原料開發新型發酵火腿，山黑豬肉干發酵過程中發酵特性研究鮮見報道。本研究以山黑豬肉為原料，添加發酵劑制作發酵肉干，研究不同發酵因素對肉干發酵過程中發酵特性的影響，旨在為山黑豬肉制品的開發提供借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后臀肉 吉林精氣神有機農業股份有限公司；木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，CICC 21445，具有蛋白酶活性）、清酒乳桿菌清酒亞種（Lactobacillus sakeisubsp.sakei，CICC 21858） 中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

HD-3A型智能水分活度測量儀 北京西化儀科技有限公司；WSF色差儀 上海儀電物理光學儀器有限公司；JY600c系列電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；UV-8000S紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；H2-16KR臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；CT3質構儀 美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 腌制配方

葡萄糖l%、食鹽2%、蔗糖l%、亞硝酸鈉0.015%、胡椒粉0.35%、料酒2.4%，各物質添加量均按肉質量百分比添加。

1.3.2 工藝流程與操作要點

工藝流程：原料肉處理→腌制→接種→發酵→干燥→包裝→終產品。

原料肉預處理：山黑豬后臀肉剔除脂肪、筋膜等雜質部分，清水沖洗干凈后沸水煮制10 min，沿豬肉紋理分割成6 cm×2 cm×2 cm的肉塊。

腌制：將腌制料按肉質量百分比加入修整好的肉塊中，混合均勻，4 ℃腌制24 h。

發酵：腌制完成后，按一定配比和接種量將發酵劑添加到肉中恒溫培養。

干燥：60 ℃干燥3 h，90 ℃干燥1 h，為保持受熱均勻和防止黏連，每30 min翻面一次。

包裝：干燥后的樣品冷卻至室溫，真空包裝。

1.3.3 發酵條件對山黑豬肉干發酵特性影響

進行單因素試驗時，各因素基本水平為發酵溫度35 ℃，接種量107CFU/g，菌種配比木糖葡萄球菌（S.xylosus）∶清酒乳桿菌清酒亞種（L.sakei）=1∶1，發酵時間32 h，試驗設計如表1所示。

表1 單因素試驗因素與水平Table 1 Coded levels of independent variables

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》進行測定。

1.3.4.2 水分活度

采用水分活度儀測定。

1.3.4.3 總游離氨基酸（free amino acids，FAAs）

參照茚三酮比色法[6]測定。

1.3.4.4 組胺含量

參照王新惠等[7]的方法測定組胺含量，并根據下式計算：

式中：X為試樣中組胺含量/（mg/100 g）；m1為試樣中組胺吸光度對應的組胺質量/μg；V1為三氯乙酸體積/mL；m2為取樣量/g。

1.3.4.5 亞硝酸殘留量

參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》鹽酸萘乙二胺法測定。

1.3.4.6 質構

將山黑豬肉樣品沿垂直肌原纖維方向切成1 cm×1 cm×1 cm的肉塊，CT3質構儀測定其硬度、彈性和咀嚼性。參數設置為：測試模式TPA，探頭TA39，目標形變值50%，測試速率1.00 mm/s，觸發點負載0.5 N，循環次數2 次。

1.3.4.7 色澤

發酵山黑豬肉干攪碎后均勻鋪設于樣品池，WSF色差儀測定樣品的亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*），順時針旋轉120°（3 次）得到3 組數據，取平均值。

1.3.4.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參考Zhou Yajun等[8]方法進行測定。取2 g發酵山黑豬肉樣品，加入20 mL蛋白提取液，均質2 min后，4 ℃、8 500 r/min離心30 min。雙縮脲法測定總蛋白質量濃度，并用1 mol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.0）調節蛋白質量濃度至（3.0±0.5）mg/mL。分離膠為10.5%，濃縮膠為4%。電壓初始值為80 V，樣品進入分離膠后調整為120 V，指示劑移至距膠下端1 cm處停止。染色液染色，再用脫色液脫色至條帶清晰，掃描成像。

1.3.4.9 感官評分

邀請10 名食品專業學生，男女各5 名，接受培訓后嚴格按照感官評分標準對山黑豬發酵肉干色澤、滋味、氣味、質地4 個方面進行評分，感官評定標準見表2。結果取平均值，保留一位小數。

表2 感官評定標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented pork jerky

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 發酵條件對山黑豬肉發酵中pH值的影響

發酵過程中pH值的快速降低有助于抑制有害菌生長，保證食品的安全性，同時低pH值促進亞硝基肌紅蛋白生成，賦予產品良好的色澤。由圖1A可知，不同配比組pH值隨發酵時間延長呈下降趨勢。1∶3組下降速度最快，3∶1組和2∶1組下降緩慢，可能是由于乳酸菌產酸能力強于木糖葡萄球菌，乳酸菌占比越大pH值下降越快。2∶1和3∶1組發酵24 h和32 h，pH值無顯著差異（P＞0.05）。可能是因為隨發酵時間延長，產酸速度減緩，在木糖葡萄球菌蛋白酶的作用下，蛋白質酶解產生的小肽、氨基酸和胺等物質對酸起到緩沖作用[9]。由圖1B可知，在發酵前16 h內，pH值下降速度隨接種量增大而加快，王志威等[10]在發酵鵝肉香腸研究中也得到相似結論。在乳酸菌消耗碳源產生有機酸和其他微生物代謝的作用下，pH值迅速下降。但發酵16～32 h，接種量為108CFU/g組pH值下降速度逐漸變緩，且最終值小于5×107CFU/g組。可能是因為接種量過大，營養物質缺乏抑制了發酵劑菌株的生長。由圖1C可知，0～8 h所有組pH值下降平緩，8～16 h，35 ℃和40 ℃組pH值下降速率遠大于其他3 組且45 ℃組下降最慢，這可能是由于溫度過高抑制乳酸菌活性。丁希等[11]也發現35 ℃時發酵灌腸pH值最低。

圖1 發酵條件對山黑豬肉發酵中pH值的影響Fig.1 Effect of fermentation conditions on pH of pork jerky during fermentation

2.2 發酵條件對山黑豬肉發酵中aw的影響

由圖2A可知，不同菌種配比導致aw呈現2種下降趨勢，2∶1和3∶1組下降速度先慢后快，1∶1、1∶2和1∶3組下降速度先快后慢。周慧敏等[12]研究表明葡萄球菌對aw影響較小，產酸能力弱，葡萄球菌占比越大，發酵前期pH值下降較慢，后期在乳酸菌的作用下形成酸性環境，加快aw值降低。乳酸菌占比越大，發酵前期pH值快速降低誘導蛋白質變性，持水力降低[13]，有利于aw的減小。另外，謝愛英等[14]在研究發酵香腸發酵過程中也發現aw和pH值呈正相關，pH值降低，aw減小。由圖2B可知，108CFU/g組在0～24 h，隨發酵時間延長aw下降最快，但最終值大于5×107CFU/g組。接種量小于5×107CFU/g時，隨接種量增大最終aw值減小。黃俊逸等[15]研究表明，接種量越大，aw下降速度越快且最終值越低。實驗結果不一致可能與接種量大小設置不同有關，當接種量大于5×107CFU/g時，營養物質不充足限制發酵菌種的生長。由圖2C可知，實驗各組aw均隨發酵時間延長呈下降趨勢，不同溫度條件下降趨勢各不相同。35 ℃組在發酵結束時aw值最低，可能是由于35 ℃為發酵菌種適生長溫度，快速產酸，pH值接近蛋白質等電點促進蛋白質凝膠化，降低持水力[16]。

圖2 發酵條件對山黑豬肉發酵中aw的影響Fig.2 Effect of fermentation conditions on aw of pork jerky during fermentation

2.3 發酵條件對山黑豬肉發酵中FAAs的影響

發酵肉制品中，肉內源酶和微生物外源酶的共同作用使蛋白質和多肽分解為小肽和FAAs，FAAs是發酵肉制品滋味形成的重要組成部分，還是許多揮發性化合物的前體，間接影響產品典型香氣的形成，所以FAAs含量對產品風味形成至關重要。由圖3A可知，所有組發酵32 h FAAs含量顯著大于發酵0 h（P＜0.05），2∶1和3∶1組由于木糖葡萄球菌含量較大，木糖葡萄球菌生長過程中分泌蛋白酶，加速蛋白質分解，因此3∶1組上升趨勢最顯著且終值最高。薛菲等[17]在研究不同發酵劑對兔肉脯FAAs的影響中得到類似結果。1∶1、1∶2和1∶3組發酵前期FAAs含量增長顯著，可能由于乳酸菌本身對蛋白質具有一定分解能力，同時可以通過快速產酸降低pH值至5.0左右，激活肉中內源組織蛋白酶，促進FAAs的產生[18]。發酵后期FAAs含量基本停止上升可能是因為發酵環境pH值過低，抑制內源組織蛋白酶和木糖葡萄球菌的活性。由圖3B可知，接種量小于108CFU/g時，FAAs含量在發酵前24 h隨接種量增大而增大。發酵時間大于24 h，108CFU/g組出現降低趨勢，可能是由于隨發酵時間延長，菌體濃度過大，營養物質不充分導致前期產生的FAAs被重新利用[19]。由圖3C可知，所有組FAAs含量在發酵過程中均呈上升趨勢，發酵32 h時不同溫度間含量差異顯著（P＜0.05）。蛋白質降解受pH值、溫度和鹽含量等多方面因素影響。30 ℃組發酵32 h，FAAs含量遠大于其他組，其他組可能因為pH值過低抑制蛋白酶活性[20]，或者溫度過低或過高抑制發酵菌種活性導致FAAs含量降低。

圖3 發酵條件對山黑豬肉發酵中FAAs含量的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on total free amino acid content of pork jerky during fermentation

2.4 發酵條件對山黑豬肉發酵中組胺含量的影響

組胺作為食品中毒性最強的胺，攝入過多會導致惡心、嘔吐和頭痛等癥狀。由圖4A可知，1∶2和1∶3組組胺含量在發酵期間增長速率緩慢。組胺含量主要和腸桿菌相關[21]，乳酸菌占比較大消耗碳水化合物快速產酸，降低pH值抑制產胺菌生長，從而控制組胺含量增長。2∶1和3∶1組的組胺含量先緩慢上升再迅速增長。有研究表明木糖葡萄球菌可以分泌胺氧化酶，將生物胺分解成過氧化氫、醛和氨等，減少組胺積累[22]。24 h前緩慢上升可能因為木糖葡萄球菌占比較大，減少組胺積累。24 h后由于有機酸的不斷積累，低pH值抑制了胺氧化酶的活性[23]，組胺含量上升。由圖4B可知，組胺含量隨發酵時間延長而增大，接種量越大，組胺含量增長越緩慢，可能是因為接種量增大促進發酵菌種迅速占領發酵優勢，抑制產胺菌生長。由圖4C可知，45 ℃和25 ℃組最終值較高。研究表明溫度通過影響發酵環境中微生物種類、數量、蛋白酶和氨基酸脫羧酶活性控制組胺含量[24]。25 ℃是組氨酸脫羧酶活性較高且穩定的溫度[25]，加速組胺形成。45 ℃組組胺含量高可能是由于溫度較高導致發酵菌種不能快速占據主導地位，無法有效抑制組氨酸脫羧酶陽性菌的生長。

圖4 發酵條件對山黑豬肉發酵中組胺含量的影響Fig.4 Effect of fermentation conditions on histamine content of pork jerky during fermentation

2.5 發酵條件對山黑豬肉發酵中亞硝酸鹽殘留的影響

亞硝酸鹽攝入人體后易與仲胺類物質反應生成亞硝胺而致癌，因此亞硝酸鹽殘留量是肉制品重要的安全問題。由圖5A可知，不同的菌種配比表現出不同趨勢。1∶1、1∶2和1∶3組在0～8 h緩慢下降，2∶1和3∶1組亞硝酸殘留量0～8 h不減反增，可能是2∶1和3∶1組木糖葡萄球菌比例較大，在木糖葡萄球菌硝酸還原酶的作用下硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；隨著發酵時間延長至8～16 h，乳酸大量積累，pH值降低，抑制硝酸還原酶活性，減少亞硝酸鹽形成，同時酸性條件下發生非酶歧化反應形成NO，與肌紅蛋白結合促進色澤形成，也降低了亞硝酸鹽殘留量[26]。由圖5B可知，發酵32 h隨接種量增大，亞硝酸鹽殘留量降低，這與郭丹等[27]研究結果一致。有研究表明乳酸菌降解亞硝酸鹽可分為2 個階段，pH值大于4.5時降解以酶的作用為主，pH值小于4.5時酶活性被抑制，以酸降解為主，酶降解速率低于酸降解速率[28]。因此隨接種量增大，產酸速率逐漸加快，亞硝酸鹽降解速率加快，含量降低。由圖5C可知，在不同溫度發酵山黑豬肉中，亞硝酸鹽殘留量隨發酵時間呈下降趨勢。在發酵溫度低于40 ℃時，亞硝酸鹽殘留量隨溫度升高而降低。可能是因為40 ℃以下，隨溫度升高逐漸達到乳酸菌適宜生長溫度，快速產酸導致pH值下降，亞硝酸鹽發生酸降解[29]，45 ℃組因溫度過高抑制乳酸菌的生長，產酸速率慢導致亞硝酸鹽殘留量下降速度慢且最終值高于其他組。劉玉等[30]研究表明發酵溫度為35 ℃時，發酵魚糜中亞硝酸鹽殘留量最低。

圖5 發酵條件對山黑豬肉發酵中亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.5 Effects of fermentation conditions on nitrite residue of pork jerky during fermentation process

2.6 發酵條件對山黑豬肉發酵后質構特性的影響

質構受食品組成成分、結構和狀態的影響，是食品結構與材料性質的感官體現。由圖6A可知，1∶3組硬度和咀嚼性最大，彈性最小，這可能與乳酸菌占比較大有關。韋誠等[31]在對酸肉研究時發現硬度、咀嚼性和pH值呈負相關，與乳酸菌數呈正相關，并解釋發酵產酸促進蛋白酸凝膠化或變性，硬度增大。3∶1組硬度和咀嚼性最小，可能是由于3∶1組木糖葡萄球菌占比大，蛋白酶活性較高，同時乳酸菌產酸激發肉內源蛋白酶活性，加速肌原纖維蛋白和肌漿蛋白分解[32]，改變肌肉質地。由圖6B可知，隨著接種量增大，硬度、咀嚼性逐漸增大，彈性下降，王亞男[33]在對牛肉雞肉混合肉糜發酵特性研究時得到相似結果，可能是因為隨接種量增大產酸速率加快，由蛋白質變性和脫水的共同作用所導致。由圖6C可知，隨溫度升高，硬度和咀嚼性先增大后減小，彈性變化不明顯。與石江濤[34]研究結果相似，35 ℃接近乳酸菌適宜生長溫度，快速產酸，低pH值環境誘導蛋白質變性，持水力下降。

圖6 發酵條件對山黑豬肉發酵后質構特性的影響Fig.6 Effect of fermentation conditions on texture properties of pork jerky

2.7 發酵條件對山黑豬肉發酵后色澤的影響

色澤是發酵肉制品重要的感官品質，良好的色澤可以激發消費者的購買欲望。由圖7A可知，3∶1組a*和L*最大，1∶3組a*和L*最小。可能是木糖葡萄球菌具有較強的硝酸鹽還原酶和過氧化氫酶活性，促進亞硝基肌紅蛋白形成，a*增大[35]。L*增大可能是因為木糖葡萄球菌蛋白酶和肉內源酶導致肌纖維松散，使光的散射和穿透發生改變，肉色變亮[36]。由圖7B可知，發酵32 h隨接種量增大，a*逐漸增大，L*逐漸下降，b*無顯著差異（P＞0.05）。Bosse等[37]研究發現，隨木糖葡萄球菌菌體濃度增大，硝酸鹽還原酶活性增強，亞硝基肌紅蛋白含量上升導致a*增大。另外，接種量增大，pH值快速降低。陳曦等[38]在香腸加工中發現低pH值加速水分的散失，L*逐漸下降。由圖7C可知，發酵32 h隨溫度升高，a*和L*先上升后下降，b*逐漸下降。可能是因為木糖葡萄球菌硝酸鹽還原酶活性在25～30 ℃隨溫度升高，活性增強，NO3－被還原為NO2－，再發生化學反應還原為NO，與肌紅蛋白結合生成亞硝基肌紅蛋白[39]。

圖7 發酵條件對山黑豬肉發酵后色澤的影響Fig.7 Effect of fermentation conditions on color parameters of pork jerky

2.8 發酵條件對山黑豬肉發酵后蛋白質SDS-PAGE的影響

由圖8A可知，與1∶1組相比，2∶1和3∶1組a、b、c、d條帶變淺，e、f條帶加深，可能是隨木糖葡萄球菌比例增大，大分子質量蛋白降解并生成小分子質量蛋白。由圖8B可知，隨接種量增大，所有條帶逐漸變淡，表明發酵菌種分泌蛋白酶濃度隨接種量增大而上升，蛋白質降解程度增大。由圖8C可知，不同發酵溫度處理組蛋白分子質量主要集中在66.4～55.0、44.3～29.0 kDa和14.3～6.6 kDa之間。與25 ℃組相比，30 ℃組h處條帶變淺，g處條帶變深，表明大分子質量蛋白被分解為小分子質量蛋白。35 ℃和40 ℃組所有分子質量的蛋白條帶變淺，可能是發酵菌達到適合溫度，蛋白酶含量增加，同時pH值迅速降低促進蛋白分解。

圖8 發酵條件對山黑豬肉發酵后蛋白質SDS-PAGE的影響Fig.8 Effect of fermentation conditions on SDS-PAGE profile of proteins pork jerky

2.9 發酵條件對山黑豬發酵肉干感官評價的影響

如圖9所示，發酵溫度30 ℃、接種量107CFU/g和菌種配比2∶1時，感官評價最優。發酵菌種都有最適生長溫度，感官評分的差異與發酵菌種在不同發酵溫度下生長活性有關。接種量通過影響發酵菌種初始濃度，生長過程中消耗和代謝產物速率不同影響產品感官品質。菌種配比不同導致發酵優勢菌不同，木糖葡萄球菌蛋白酶和脂肪酶活性強，分解蛋白和脂肪釋放更多風味物質，分泌硝酸鹽還原酶和過氧化氫酶起到護色和抗氧化作用[40]。清酒乳桿菌清酒亞種產酸速率快，低酸環境抑制腐敗菌和致病菌的生長，導致酸凝膠化或蛋白變性，促進亞硝酸鹽分解為NO并與肌紅蛋白結合，改善質構和色澤[41]。因此菌種配比不同，感官品質不同。

圖9 發酵條件對山黑豬肉干感官評分的影響Fig.9 Effect of fermentation conditions on sensory scores of pork jerky

3 討論與結論

探究發酵溫度、接種量和菌種配比對山黑豬肉干發酵過程中理化指標和感官指標的結果表明，隨發酵時間延長，pH值、aw、亞硝酸鹽殘留量整體降低，FAAs和組胺含量逐漸增大。

發酵工藝主要通過影響發酵菌種的生長活性、菌種濃度以及肉內源酶活性改變發酵特性。不同菌種配比組中，隨著木糖葡萄球菌占比增大，FAAs含量、L*、a*逐漸升高（P＜0.05）；隨著清酒乳桿菌清酒亞種占比增大，pH值、aw降低，硬度和咀嚼性增大（P＜0.05）。結合多方面因素，菌種配比為1∶1、2∶1、1∶2時，發酵山黑豬肉干品質較優。吳海燕[42]對發酵金絲魚研究發現，戊糖片球菌和木糖葡萄球菌接種比例為1∶2時，產品品質最佳。夏秀芳等[43]對發酵牛肉串品質特性研究發現，隨木糖葡萄球菌占比增大，pH值和a*逐漸增大，硬度減小。

發酵32 h，隨接種量增大，組胺含量上升趨勢減緩，亞硝酸鹽殘留量、彈性降低（P＜0.05 ），硬度、咀嚼性、a*逐漸增大（P＜0.05 ），107CFU/g組感官評價最佳，綜合評價選取5×106～5×107CFU/g為較優接種量。郭丹等[27]對發酵香腸研究表明，隨接種量增大，亞硝酸鹽降解率增大，殘留量減小。黃俊逸等[44]在香腸加工中發現隨接種量增大，硬度、咀嚼性增大，彈性下降。

發酵32 h，隨發酵溫度升高pH值、aw、亞硝酸殘留量呈現先降低后升高的趨勢，FAAs、硬度、咀嚼性、L*和a*顯示先增大后減小的趨勢，結果表明當發酵溫度為30～35 ℃時，發酵山黑豬肉干品質較好。陳亞杰[45]和張鳳寬[46]等對發酵香腸工藝研究也發現，發酵溫度為30 ℃時香腸品質最佳。

綜上所述，當發酵時間為24～32 h，發酵溫度為30～35 ℃，接種量為5×106～5×107CFU/g，菌種配比為1∶1、1∶2和2∶1時，發酵山黑豬肉干品質較好。