大黃泄濁方對5/6腎切除大鼠腎組織中內質網應激相關蛋白GRP78、CHOP表達的影響*

河北中醫學院第一附屬醫院

張欣欣 辛 鑫 吳振華 檀 淼△ 楊鳳文 張翠輕 陳素枝 袁國棟 檀金川(石家莊 050011)

提要 目的：通過研究大黃泄濁方對5/6腎切除大鼠腎組織中內質網應激(ERS)相關蛋白的影響，探討其保護腎功能延緩腎間質纖維化(RIF)的作用機制。方法：90只健康SD雄性大鼠隨機分為假手術組，模型組，大黃泄濁方低、中、高劑量(6.825、13.650、27.300 g/kg)組和尿毒清顆粒組(2.600 g/kg)。除假手術組外，其余均采用5/6腎切除手術誘導慢性腎衰竭(CRF)大鼠模型。模型誘導成功后，各藥物干預組分別予規定劑量的藥物混懸液灌胃，每日1次，連續8周。給藥結束后，檢測大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平和24 h尿蛋白定量(UTP)；Masson染色觀察RIF程度；免疫組織化學法檢測腎組織中葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、轉錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達情況。結果：與假手術組相比，模型組大鼠血Scr、BUN、UTP水平顯著增高(P<0.05)，腎間質發生顯著纖維化，GRP78、CHOP蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，大黃泄濁方各劑量組和尿毒清顆粒組血Scr、BUN、UTP水平具有不同程度降低(P<0.05)，RIF不同程度改善，GRP78、CHOP蛋白表達顯著降低(P<0.05)。結論：大黃泄濁方可減輕5/6腎切除術誘導的CRF大鼠腎功能惡化、改善RIF病理改變，其機制可能與降低GRP78、CHOP蛋白表達以抑制ERS有關。

腎間質纖維化(RIF)是各種腎臟疾病進展到一定階段表現出的共同病理特征，是腎臟結構損害和腎功能障礙的重要原因之一[1- 2]。減輕RIF病理進程對于減緩慢性腎衰竭(CRF)進展和保護腎功能具有十分重要的意義。內質網應激(ERS)在RIF進程中扮有重要角色[3]，適度的ERS對于維持內質網穩態、細胞存活和延緩RIF至關重要；但過強的ERS會誘導腎臟實質細胞發生凋亡，增加腎臟結構不可逆性損傷，進而加速了RIF的進展[4]。

中藥復方在延緩腎纖維化、減輕腎損傷和延緩腎衰進程方面具有顯著療效[5-7]。大黃泄濁方(由大黃、黃芪、土茯苓、水牛角絲、丹參、當歸、醋龜甲、地龍、積雪草組成)是導師檀金川教授治療CRF的常用中藥復方，目前已經成為河北省中醫院院內制劑，組方針對CRF患者“脾腎虧虛、濕熱瘀蘊結”特點，具有健脾益腎、清熱利濕、化瘀通絡、泄濁解毒的功效，臨床應用時發現在改善患者腎衰癥狀、降低血肌酐(Scr)和降低尿蛋白等方面均取得較好的療效，但具體的作用機制尚不明確。葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、轉錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白是ERS相關蛋白，本研究通過觀察大黃泄濁方對CRF大鼠腎組織中ERS相關蛋白GRP78、CHOP表達的影響，探討其保護腎功能延緩RIF的作用機制，以期為其臨床運用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康SD雄性大鼠[(6～8周齡、體質量(160±20)g]90只，遼寧長生生物技術有限公司提供[許可證書編號SCXK(遼)2020-0001]；在河北中醫學院SPF級實驗動物中心飼養，自由飲水及進食。

1.2 藥物 大黃泄濁方所有藥材均來自于河北省中醫院中藥房，中藥配方顆粒由廣東一方制藥有限公司提供(藥物批號：大黃0060243、黃芪0071088、土茯苓0080923、水牛角絲0066623、丹參0071563、當歸0070963、醋龜甲0076823、地龍0057083、積雪草0055443)，中藥顆粒中生藥含量分別為大黃10 g、黃芪25 g、土茯苓20 g、水牛角絲15 g、丹參12 g、當歸10 g、醋龜甲15 g、地龍9 g、積雪草15 g；尿毒清顆粒(5 g×18袋，由內蒙古康臣藥業有限責任公司生產，國藥準字Z20073256)。

1.3 主要試劑及儀器 血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白定量(UTP)檢測試劑盒，購自南京建成生物；馬松(Masson)染色液，購自北京雷根生物科技有限公司；CHOP、GRP78一抗，分別購自美國affinity公司和美國abcam公司；二抗，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；BX53顯微鏡，日本奧林巴斯公司；RM2015型切片機，德國Leica公司；7170A全自動生化儀，日本日立公司。

2 方法

2.1 模型制備 按照5/6腎切除法制備CRF大鼠模型[8]。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將其固定于手術操作臺上，左側背部剔毛、備皮、常規消毒，距左肋脊角1.5 cm處做一縱向皮膚切口(長約3 cm)，逐層分離皮膚、皮下組織、脂肪肌肉等各層進入后腹腔，暴露左側腎臟，動脈夾結扎腎蒂，切除以腎皮質為主的2/3腎組織，明膠海綿墊壓迫止血，復位腎臟，縫合切口并進行包扎，為預防感染，術后腹腔注射青霉素。1周后進行第2次手術，按照上述方法行右腎全切術。術后4周，隨機抽取2只假手術組和2只造模組化驗檢測Scr、BUN、UTP水平，造模組較假手術組比較血Scr、BUN和UTP含量明顯增加，處死大鼠并留取腎臟標本進行Masson染色觀察腎間質纖維化程度，造模組大鼠腎間質有明顯的纖維化，提示模型制備成功[6,8]。

2.2 分組及給藥 90只健康的SD雄性大鼠采用隨機數字表法隨機分為假手術組，模型組，大黃泄濁方組(低、中、高)，尿毒清顆粒組，每組均15只。假手術組僅做雙腎被膜剝離術，其余5組均按照2.1方法制備CRF大鼠模型，模型復制成功后，各給藥組均按照相應劑量灌胃治療。依據人與大鼠體表面積折算法計算大鼠的臨床等效劑量，大黃泄濁方中劑量給藥量為13.65 g/kg·d-1，中劑量的1/2、2倍分別為低劑量(6.825 g/kg·d-1)、高劑量(27.300 g/kg·d-1)，尿毒清顆粒組給藥量為2.600 g/kg·d-1，以大鼠10 mL/kg的體質量標準灌胃給藥，每日1次，連續給藥8周。假手術組、模型組在同等時間點給予同等劑量的蒸餾水灌胃。

2.3 指標檢測

2.3.1 血Scr、BUN及UTP定量的檢測: 全自動生化分析儀檢測大鼠血清中BUN、Scr水平，尿液分析儀檢測UTP水平。均嚴格按照試劑盒的要求進行。

2.3.2 Masson染色檢測腎臟病理學改變：將固定于4%多聚甲醛中的腎組織取出，進行脫水、透明組織、石蠟包埋，連續切片(厚度為4 μm)，進行Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎臟膠原纖維沉積情況。

2.3.3 免疫組織化學法檢測GRP78、CHOP蛋白的表達情況：取腎組織切片，脫蠟、水化、細胞通透、封閉內源性過氧化物酶，抗原修復，山羊血清封閉，加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次后滴加稀釋好的二抗，37 ℃孵育。PBS清洗，DAB染色避光顯色，在顯微鏡下觀察棕褐色染色為蛋白的陽性表達后水洗、復染、脫水、透明和封片。使用image Pro plus 6.0軟件進行結果分析。

3 結果

3.1 大黃泄濁方對CRF大鼠血Scr、BUN及UTP水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠血Scr、BUN、UTP水平顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，各給藥物組大鼠血Scr、BUN、UTP水平均有不同程度下降(P<0.05)，其中大黃泄濁方中、高劑量組療效明顯優于大黃泄濁方低劑量組和尿毒清顆粒組(P<0.05)。詳見表1。

表1 大黃泄濁方對CRF大鼠Scr、BUN及24 hUTP水平的影響

3.2 大黃泄濁方對CRF大鼠RIF的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腎組織中可見大量膠原纖維沉積；與模型組相比，大黃泄濁方各劑量組和尿毒清顆粒組各腎組織中膠原纖維沉積情況有不同程度改善，其中以大黃泄濁方中、高劑量組改善明顯。見圖1。

注：A.假手術組；B.模型組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組；F.尿毒清顆粒組。(圖2、圖3同)

3.3 大黃泄濁方對CRF大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達的影響 GRP78、CHOP在正常腎組織中少量表達，腎小管上皮細胞為陽性主要表達部位；與假手術組相比，模型組大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，大黃泄濁方各劑量組和尿毒清顆粒組大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達含量均有不同程度降低(P<0.05)，其中大黃泄濁方中、高劑量組大鼠腎小管中GRP78、CHOP蛋白表達量降低程度明顯優于大黃泄濁方低劑量組和尿毒清顆粒組(P<0.05)。詳見表2、圖2、圖3。

圖2 大黃泄濁方對CRF大鼠腎組織中GRP78蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

表2 大黃泄濁方對CRF大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達的影響

圖3 大黃泄濁方對CRF大鼠腎組織中CHOP蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

4 討論

中醫學上將CRF歸屬為“水腫”“腰痛”“腎勞”等范疇。導師檀金川教授認為“虛、濁、瘀、毒”是CRF發生發展過程中的四大主要病機。虛為病之根本，以脾腎兩虛為主，是RIF形成的根本。脾腎虧虛，水濕不化積聚日久化熱成瘀，濕熱瘀蘊結，濁毒內生，濕熱、瘀血、濁毒錯綜交叉為病之關鍵，是RIF形成的病理學基礎。治療上應當標本兼顧，健脾益腎培其本，針對標實之邪，更應注重清熱利濕、化瘀通絡、泄濁解毒等治法。大黃泄濁方(由大黃、黃芪、土茯苓、水牛角絲、丹參、當歸、醋龜甲、地龍、積雪草組成)是導師檀金川教授根據CRF患者的臨床癥狀特點，以“脾腎兩虛、濕熱瘀蘊結”的病機要點為依據提出的治療CRF的常用中藥復方，取得較好的臨床療效。方中大黃、黃芪為君藥，健脾補腎兼活血化瘀、泄濁解毒，標本兼顧；土茯苓、積雪草清熱利濕、泄濁解毒，共為臣藥以助君藥健脾益腎；丹參活血祛瘀、當歸活血且補血，使瘀血得散、活血而不傷正氣；醋龜甲滋陰清熱、水牛角絲清熱涼血；蟲類藥地龍，善行走竄，通腎絡、清除久積之邪。諸藥合用，切合“脾腎虧虛、濕熱瘀蘊結”的基本病機，具有健脾益腎、清熱利濕、化瘀通絡、泄濁解毒之功效，適用于CRF早、中期治療。在本研究中，模型組在造模后出現UTP、血Scr、BUN水平升高，腎臟病理顯示腎組織大量膠原纖維沉積提示模型復制成功；給予大黃泄濁方干預后，血Scr、BUN、UTP水平降低，腎臟膠原纖維沉積減少，表明大黃泄濁方具有減緩RIF、降低尿蛋白和改善腎功能進而緩解CRF進展的作用。

研究表明，CRF疾病過程中存在ERS反應的激活，這可能與尿毒癥毒素的積聚、微炎癥狀態及脂類代謝紊亂密切相關[9]。若ERS持續存在，超過未折疊蛋白反應(UPR)能力，激活下游凋亡相關基因，會誘導細胞發生不可逆的凋亡[10]。ERS誘導的細胞凋亡加速了腎臟纖維化進程，抑制ERS表現出顯著的腎臟保護作用[11]。GRP78是一種廣泛存在于真核生物細胞中ER膜上的分子伴侶熱休克蛋白，是UPR跨膜壓力的重要傳感器[12]。通常GRP78是無活性的，然而ERS發生時，GRP78解離恢復活性優先和錯誤折疊的蛋白結合以促使恢復正常結構，維持內質網(ER)穩態[12]。本研究中，模型組大鼠GRP78表達量顯著增高，提示ERS反應被激活，這與既往研究一致[3, 7]。CHOP在多種功能不同蛋白質的基因表達方面扮有重要角色，是ERS誘導細胞發生不可逆性凋亡的關鍵調控基因。既往研究顯示，沉默CHOP基因降低其表達可有效降低C57BL/6小鼠尿蛋白水平，腎間質炎癥和纖維化也隨之減輕，證實調控CHOP轉錄活性在腎臟損害中發揮重要作用[13]。本研究中，模型組大鼠GRP78、CHOP表達量均明顯增加，給予大黃泄濁方干預后其含量較模型組均明顯減少，表明大黃泄濁方可能通過抑制ERS，減少凋亡，發揮腎臟保護的作用。

綜上所述，大黃泄濁方能明顯降低血Scr、血BUN水平，降低UTP水平，減緩RIF進程，其機制可能與調控ERS相關蛋白GRP78、CHOP的表達、抑制ERS的激活有關，但其他具體的分子機制有待于進一步探討。