電針聯(lián)合再灌注對急性腦梗死大鼠腦損傷的影響※

●陳桂云 金海鵬 李相良 施鎮(zhèn)國 王 永

Lancet 發(fā)表的最新中國疾病負擔(dān)報告[1]顯示，1990—2017年，腦卒中取代了下呼吸道感染和新生兒疾病，成為國民死亡、殘疾調(diào)整壽命年數(shù)（DALYs）、和疾病負擔(dān)的主要原因。而缺血性卒中又占卒中的70%～80%[2]，其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會、家庭帶來沉重的負擔(dān)。急性缺血性卒中治療的關(guān)鍵在于盡早開通阻塞血管、挽救缺血半暗帶。最新發(fā)表的九大溶栓隨機對照研究的匯總分析顯示，與對照組相比，靜脈溶栓后3～6個月死亡率未明顯降低，仍高達17.9%，且2∕3 的患者依然遺留有不同程度的殘疾[3]，因此，找到一個優(yōu)于溶栓劑或提高其療效的急性缺血性腦卒中的治療方法仍然是一個亟待解決的問題。目前，在所有電針預(yù)處理對急性腦缺血再灌注損傷的研究中，電針預(yù)處理干預(yù)的時間窗都在腦缺血前，雖然證實了電針預(yù)處理能誘導(dǎo)腦缺血耐受，但因患者發(fā)生腦梗死的時間窗是未知的，其在臨床的應(yīng)用尚缺乏可行性。本研究立足于臨床，通過建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，將電針預(yù)處理的時間窗置于再灌注前，即模擬急性腦梗死患者在溶栓前接受電針水溝穴和百會穴治療，探索提高再灌注后進一步減小腦神經(jīng)功能缺損癥狀的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購于廈門大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（閩）2008-0001。于實驗前適應(yīng)環(huán)境1 w，控制室溫（22±1）℃，濕度（55±5）%，光照時間7：00～19：00，自由攝食和飲水，在廈門大學(xué)動物實驗中心分組飼養(yǎng)。按照隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組，分別是假手術(shù)組、MCAo組、再灌注組和電針+再灌注組，每組20 只。在實驗過程中死亡及造模不合格的大鼠由備用大鼠補齊。

1.2 主要試劑和儀器2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（美國Sigma）；TUNEL 試劑盒（美國Roche）；戊巴比妥鈉（德國Merck）；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司）；熒光顯微鏡（德國Leica）；切片機（德國Leica）。

1.3 動物模型制備參照Zea Longa[4]線栓法加以改進制作大腦中動脈缺血再灌注模型（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAo）。術(shù)前12 h 對大鼠禁食，6 h禁水。先用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL∕100 g）進行腹腔注射麻醉，再將大鼠仰臥位固定，線栓從頸外動脈至頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈，線栓深入顱內(nèi)約18～20 mm。再灌注組阻斷110 min后拔出線栓，完成缺血再灌注。電針組阻斷90 min時以電針干預(yù)20 min后撥出線栓，完成缺血再灌注模型。假手術(shù)組除不插線栓外其余步驟同MCAo組。

1.4 電針干預(yù)方法大鼠水溝穴和百會穴定位參照《實驗針灸學(xué)》[5]穴位標準。在大腦中動脈缺血90 min后，予電針干預(yù)1 次。操作方法：將0.25 mm×13 mm無菌針灸針（華佗牌）分別刺入大鼠水溝穴和百會穴，水溝穴針尖朝向鼻中隔方向針刺2 mm，百會穴針向前平刺2 mm，連接好電針治療儀導(dǎo)線。應(yīng)用韓式穴位神經(jīng)刺激儀（HANS E200），選用疏密波，電流強度1 mA，頻率2∕15 Hz，時間20 min。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 神經(jīng)功能評分 大鼠造模后24 h，每組隨機取10只，參照Zausinger[6]評分法對其進行神經(jīng)功能評分，具體如下：①無法行動，評為0分；②向右轉(zhuǎn)圈，評為1 分；③提起鼠尾，若有很明顯的向右旋轉(zhuǎn)且沒有發(fā)現(xiàn)向左旋轉(zhuǎn)，評為2分；④將排除2分的大鼠置于平地，手抓住鼠尾固定大鼠，分別對其兩側(cè)施加同樣的壓力，若右側(cè)抵抗力不如左側(cè)，則評為3分；⑤將排除3 分的大鼠讓其自由活動，觀察其右側(cè)前爪是否能伸直，若無法伸直評為4分；⑥若雙側(cè)沒有任何區(qū)別，評為5分。

1.5.2 TTC 染色觀察大鼠大腦梗死面積 神經(jīng)行為學(xué)評分后，每組隨機取10只大鼠采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后斷頭取腦，將大鼠大腦切成2 mm 的冠狀切片。將腦切片放入2%TTC溶液，于37 ℃溫箱中孵育10 min，再用4%多聚甲醛溶液固定后拍照，使用image pro plus 6.0軟件測定梗死面積（梗死面積=對側(cè)半球面積-病變半球非梗死面積），然后計算相對腦梗死面積百分比，即梗死面積與對側(cè)半球面積的比值。

1.5.3 TUNEL染色檢測大鼠大腦皮層缺血半暗帶細胞凋亡 TTC 染色后，每組取另外10 只大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛溶液約100 mL，將其在4%多聚甲醛中固定過夜，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度10 μm）。切片常規(guī)脫臘、抗原修復(fù)后將切片與TUNEL 試劑混合液室溫背光孵育1 h。PBS 洗滌后，用DAPI 核染色劑觀察細胞核。由對分組不知情的研究人員使用400 倍熒光顯微鏡在每個切片中隨機觀察大腦皮層缺血半暗帶區(qū)5 個不同視野，并計數(shù)TUNEL 陽性細胞的數(shù)量占總細胞數(shù)量的百分比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 19.0 系統(tǒng)軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示。首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗（One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test，K-S 檢驗），檢驗水準α=0.05，符合正態(tài)分布者，多組間數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差不齊采用Dunnett’s T3 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較經(jīng)單因素方差分析，各組大鼠神經(jīng)功能評分有顯著差異（P＜0.01）。各組經(jīng)兩兩比較，MCAo 組大鼠神經(jīng)功能評分顯著低于假手術(shù)組（P＜0.01）；經(jīng)再灌注干預(yù)，再灌注組大鼠神經(jīng)功能評分顯著高于MCAo 組（P＜0.01）；而經(jīng)電針干預(yù)后再進行再灌注處理，電針+再灌注組大鼠的神經(jīng)功能評分較再灌注組又有顯著提高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠干預(yù)后神經(jīng)功能評分比較

2.2 各組大鼠相對腦梗死面積百分比比較經(jīng)單因素方差分析，各組大鼠相對腦梗死面積百分比有顯著差異（P＜0.01）。各組經(jīng)兩兩比較，MCAo 組大鼠相對腦梗死面積百分比顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；經(jīng)再灌注干預(yù)，再灌注組大鼠相對腦梗死面積百分比較MCAo 組顯著降低（P＜0.01）；而經(jīng)電針干預(yù)后再進行再灌注處理，電針+再灌注組大鼠的相對腦梗死面積百分比較再灌注組進一步顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠干預(yù)后相對腦梗死面積百分比比較

2.3 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細胞凋亡水平比較經(jīng)單因素方差分析，各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細胞凋亡水平有顯著差異（P＜0.01）。各組經(jīng)兩兩比較，MCAo 組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細胞凋亡水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；經(jīng)再灌注干預(yù)，再灌注組顯著低于MCAo 組（P＜0.01）；而經(jīng)電針干預(yù)后再進行再灌注處理，電針+再灌注組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細胞凋亡水平較再灌注組又有顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠干預(yù)后大腦皮層缺血半暗帶TUNEL凋亡陽性細胞率比較

3 討論

石學(xué)敏院士于1972 年開創(chuàng)“醒腦開竅”針刺法治療中風(fēng)病，其基于對古醫(yī)籍及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的深入研究，創(chuàng)先提出對中醫(yī)理論中“神”的把握及對中風(fēng)病病機“竅閉神匿，神不導(dǎo)氣”的認識，明確其病位在腦，確立了以醒腦開竅、滋補肝腎為主，疏通經(jīng)絡(luò)為輔的針刺治療方法，經(jīng)過四十年的臨床驗證，取得了顯著的療效[7-10]。水溝穴是“醒腦開竅”的主穴，系督脈穴，為手、足陽明經(jīng)與督脈的交會穴，可調(diào)督脈、開竅啟閉，醒腦寧神，而使機體生命活動恢復(fù)，為臨床上常用的急救穴。另外，中醫(yī)學(xué)認為，腦為髓海，其氣血輸注上在于百會穴，下在于風(fēng)府穴。而督脈總督一身之陽脈，為“陽脈之海”，其起于胞中，下出會陰，沿脊內(nèi)上行至項進入腦內(nèi)，屬腦。百會穴屬于督脈，根據(jù)“經(jīng)脈所過，主治所及”的經(jīng)絡(luò)理論，百會穴在治療腦血管疾病和脊髓相關(guān)疾病方面具有相對特異性和優(yōu)勢。從現(xiàn)代解剖學(xué)角度看，百會穴正下投影正好處于皮質(zhì)運動、感覺區(qū)的投影區(qū)內(nèi)，同時大腦前動脈主干也在其下走行。故本研究取水溝穴、百會穴共同干預(yù)急性腦缺血模型大鼠。隨著近代臨床醫(yī)生將電刺激引入針灸領(lǐng)域，針灸治療手段得到了擴展和補充，而電針在卒中后的康復(fù)治療更是取得了一定的療效[11-16]。由于電針參數(shù)易于控制，將刺激量化，使治療量更精確，故可作為急性缺血性卒中救治的手段。

腦缺血后的溶栓治療，不僅要面臨腦出血的風(fēng)險，還要考慮其它副作用，其中一個很重要的方面就是腦缺血再灌注損傷（CIRI）。腦缺血再灌注損傷的主要病理變化為細胞凋亡，凋亡是機體為了維護內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定，通過多種途徑使細胞主動死亡的過程，屬于一種生理性的細胞死亡，是可逆的。因此，本研究將電針干預(yù)置于再灌注前，明確大腦中動脈缺血后，從神經(jīng)行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和細胞病理學(xué)角度，再灌注前電針水溝穴和百會穴可以進一步改善大腦中動脈缺血性損傷，同時也在一定程度上逆轉(zhuǎn)了缺血半暗帶再灌注引起的神經(jīng)元凋亡，為急性腦梗死患者溶栓治療前予電針干預(yù)的可行性提供了基礎(chǔ)實驗依據(jù)，以期未來可將這一治療手段應(yīng)用于急性腦梗死的搶救治療中。筆者團隊將在后續(xù)的研究中探索相關(guān)機制，如電針聯(lián)合再灌注如何通過鈣超載、炎癥、氧化應(yīng)激等途徑改善缺血性腦梗死的神經(jīng)元凋亡。