血管內皮生長因子-2578基因多態性與下肢動脈粥樣硬化的相關性

李愛英，趙曉斐 (.山東省軍區青島第五離職干部休養所，山東 青島 66000；.連云港市第二人民醫院，江蘇 連云港 006)

下肢動脈粥樣硬化是一種退行性變，嚴重者可引起下肢供血動脈管腔狹窄、閉塞，表現為皮溫降低、疼痛、間歇性跛行，降低患者生活質量[1]。由動脈粥樣硬化導致截肢引起的急性死亡率達30%,5年后生存率<30%。周圍血管性病變與心腦血管性疾病的發生相關聯，動脈粥樣硬化是其危險因素[2-4]，其發病率高達正常人的6倍[5]。研究周圍血管病變，盡早及時干預顯得尤為重要。下肢動脈粥樣硬化除了與高血脂、吸煙、高血壓等可控制因素有關外，還和不可調控的因素基因有關[6]。

1 資料與方法

1.1一般資料：本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。選擇2018年9月～2019年11月在連云港市第二人民醫院老年科年齡45～80歲之間的患者267例。根據下肢血管超聲檢查結果，分為內中膜(intima-mediathickness,IMT)增厚組171例和對照組96例，其中，增厚組男92例，女79例，年齡(64.30±9.29)歲，對照組男59例，女37例,年齡(67.15±9.63)歲。排除炎性反應、腫瘤、肝腎功能嚴重損害的患者。受試者均簽署知情同意書。

1.2采集樣本：抽取患者靜脈血3 ml置乙二胺四乙酸二納(EDTA)抗凝管中，-80℃冰箱儲存，提取DNA備用。

1.3提取DNA：將-80℃冰箱儲存的備用血于4℃冰箱隔夜。取全血200 μl，根據離心柱型全血基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)說明書提取DNA。經紫外分光光度計比色定量，總DNA 12.05～30.1 μg。提取的DNA放置在-20℃的冰箱保存。

1.4檢測VEGF基因-2578C/A多態性：將含VEGF 2578C/A的DNA片段PCR擴增，引物序列[7]由上海生工生物工程股份有限公司合成，上游引物序列分別為5'-CTCCACCAAACCACAGCAAC-3'，下游引物序列為5'-GGCTACTTCTCCAGGCTCAC-3' 。反應體系50 μl:2 ×Reaction Mix 25 μl,上下游引物(10 μM)分別2 μl,Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl)1 μl,用超純水補至50 μl。PCR反應：94℃預變性5 min,94℃變性45 s,60.5℃退火45 s,72℃延伸45 s，循環35次，然后72 ℃延伸7 min。擴增的片段用1.5%瓊脂糖凝膠電泳[8]。見圖1；并送融智公司測序。見圖2。

圖1 PCR擴增后于1.5%瓊脂糖凝膠電泳

分別為基因CC/CA/AA序列圖2 PCR基因測序圖

1.5測量下肢血管IMT：利用無創性的B型超聲測量下肢血管內中膜厚度 。所有受檢者均接受日本ALOKA5500 彩色多普勒超聲檢測儀檢查。患者取平臥位充分暴露雙下肢，對受檢者的足背動脈、脛后動脈、脛前動脈、腘動脈、股動脈等進行檢查。診斷標準[ 9]: 觀察指標利用血管內中膜厚度作為動脈粥樣硬化的評定標準: IMT≥1.0 mm表示管壁增厚。

2 結果

2.1兩組間一般情況的比較：增厚組和對照組比較，年齡、體重指數差異無統計學意義(P>0.05)。吸煙、高血壓、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 下肢動脈IMT增厚組與對照組基本資料的比較

2.2IMT增厚組和對照組基因型與等位基因頻率比較：兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。兩組間VEGF-2578C/A基因型及等位基因的差異有統計學意義(P<0.05， 2值分別為6.85、3.977)。見表2。

表2 位點VEGF-2578C/A基因型與等位基因分布[例(%)]

2.3血管內皮生長因子2578位點基因多態性與下肢動脈內中膜增厚易患性的關聯分析：以高血壓、吸煙、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白為自變量，IMT增厚為應變量進行多變量Logistic回歸分析，吸煙(OR2.232，CI%1.096～4.545；P=0.026)、高血壓(OR7.539，CI%1.886～3.014；P=0.004)以及CC基因型(OR1.695，CI%1.694～1.695；P=0.002)是下肢動脈IMT增厚的獨立危險因素。

3 討論

下肢動脈粥樣硬化是中老年人中發生率最高的一種動脈粥樣硬化疾病[10]。損傷的下肢血管內皮引起粥樣硬化，進一步導致動脈血管狹窄或閉塞，逐年呈上升趨勢[7]。

VEGF基因全長14kb，位于6 p12染色體上,由7個內含子和8個外顯子構成[11]。VEGF作為一種生長因子，廣泛表達于正常組織和病變組織，在血管生成中發揮重要作用，并且和腫瘤、心腦血管疾病、風濕性關節炎、視網膜增生等疾病相關。VEGF在血管的保護、重塑中發揮重要作用。Howell等發現VEGF-2578基因型與冠心病的嚴重程度高度相關，基因型AA為獨立危險因素[12]。故本實驗探討VEGF啟動子(2578)的單基因核苷酸基因多態性與下肢動脈粥樣硬化的相關性，研究發現-2578C/A基因型C/C、C/A、A/A的構成比和等位基因C、A的頻率在IMT增厚組和對照組之間存在顯著差異，在IMT增厚組中-2578C/A位點等位基因C的頻率明顯高于對照組。進一步行多因素Logistic回歸分析，發現基因型CC與下肢動脈內皮增厚存在顯著相關性。既往的研究-2578C/A位點基因型與IMT厚度無關聯[13]，CC基因型為動脈粥樣硬化的保護因素，AA基因型為獨立危險因素。本研究的結果與之相反，不排除與樣本選擇差異、種族或其他基因存在交互作用等因素有關。

綜上所述，本研究表明漢族人群中VEGF啟動子-2578位點的單核苷酸多態性與IMT有相關性， C等位基因可能增加下肢動脈粥樣硬化發生的風險，其確切機制有待于進一步研究。下肢動脈粥樣硬化是環境、遺傳共同影響的疾病，本研究樣本量小，可能存在偏倚，需增加樣本量證實結果的可靠性。