七氟烷通過調控miRNA 表達影響人腦膠質瘤的生物學特性

韓勁松 姜崇發 李印玉 侯俊鋒 謝宏偉 李治松

（1 周口市中心醫院麻醉科,河南 周口 466000;2 鄭州大學第一附屬醫院麻醉科）

腦膠質瘤是常見的腦原發性惡性腫瘤，其惡性程度高，侵襲性強、易復發，手術結合放化療、分子靶向治療等綜合治療手段能有效降低腫瘤復發，提升患者生存率〔1〕。麻醉藥是手術中常用藥物，研究麻醉藥對膠質瘤細胞轉移的影響，并闡明其可能的機制，可為合理應用麻醉藥及改善患者預后提供新思路〔2〕。七氟烷是一種新型吸入麻醉藥，理化性質穩定，具有平穩誘導、蘇醒快、有一定的肌松作用等優點，已廣泛應用于臨床麻醉〔3〕。七氟烷可抑制人乳腺癌細胞的轉移能力，其機制可能與下調基質金屬蛋白酶（MMP）-9 表達有關〔4〕。七氟烷能抑制人肺腺癌A549 細胞增殖，促進細胞凋亡，增強A549 細胞對順鉑的敏感性，還通過下調MMP-2、MMP-9 抑制A549 細胞的侵襲、遷移〔5〕。用七氟烷麻醉患者含藥血清處理人膠質瘤細胞SHG-44，可抑制細胞增殖、侵襲和遷移能力〔6〕。但七氟烷影響人腦膠質瘤生物學特性的機制還尚不清楚。微小RNA（miRNA）可以通過調控靶基因表達影響腦膠質瘤進展〔7〕。研究發現miR-139-5p 過表達可抑制膠質瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡〔8〕。miR-139-5p 還可通過與E26 轉錄因子（ETS1）相互作用抑制肝細胞癌的增殖，遷移和侵襲〔9〕。神經元五聚蛋白（NPTX）1 定位于染色體17q25.3，調節多種細胞生物學過程，NPTX1 在結腸癌中下調表達，NPTX1 過表達通過下調細胞周期蛋白A2 和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）2 表達抑制結腸癌細胞增殖〔10〕。NPTX1 還是腦缺氧缺血性損傷的新型介質，與缺氧神經元損傷相關〔11〕。但NPTX1 對腦膠質瘤的影響及七氟烷是否通過miR-139-5p 和NPTX1 影響腦膠質瘤的生物學行為還尚不清楚。本實驗研究七氟烷是否通過miR-139-5p 和NPTX1 影響腦膠質瘤的進展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 膠質瘤細胞A172 購自美國ATCC 庫；DMEM 培養基、四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒購自美國Sigma 公司；七氟烷購自日本Maruishi Pharmaceutical 公司；Transwell 小室、基質膠購自美國BD 公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen 公司；蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京Solarbio 公司。anti-miR-con、antimiR-139-5p、miR-con、miR-139-5p、pcDNA 和pcDNA-NPTX1 載體質粒由上海伯易生物科技有限公司構建。

1.2 細胞培養與分組 將細胞A172 分別在通入1.25%、2.50%、5.00% 的七氟烷和5% CO2+95%O2的DMEM 培養基中培養，氣流量均為1 L/min，作為七氟烷處理組分別記為Sevoflurane 1.25%、2.50%、5.00% 組，對照（NC）組只通入5% CO2+95% O2。將pcDNA 和pcDNA-NPTX1 質粒分別轉染至A172 細胞中再用5.00%的七氟烷處理，分別記為Sevoflurane+pcDNA 組、Sevoflurane+pcDNANPTX1 組。

1.3 MTT 檢測細胞存活率 各組細胞培養24 h、48 h、72 h，按試劑盒說明操作加入MTT 試劑，酶標儀檢測490 nm 的吸光度（OD）值。計算細胞存活率=實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.4 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 遷移:取200 μl細胞懸液接種于Transwell 小室上室，下室加含血清培養基，培養24 h，分別經多聚甲醛固、0.1%結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數。侵襲:用基質膠包被Transwell 上室，風干后按照遷移實驗步驟操作。

1.5 Western 印跡檢測MMP-9、MMP-2、NPTX1、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經鈣黏蛋白（N-cadherin）表達水平 提取細胞總蛋白，定量后上樣并進行電泳，然后轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，封閉后加入一抗4℃孵育過夜；再加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度值，計算蛋白相對表達水平。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-139-5p 和NPTX1 mRNA 表達水平 提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒配制反應體系，miR-139-5p 和NPTX1 分別以U6 和β-actin 為內參進行PCR 擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.7 熒光素酶報告實驗檢測miR-139-5p 和NPTX1的靶向關系 構建NPTX1 野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-NPTX1 和MUT-NPTX1，將其分別與miR-con 和miR-139-5p 共轉染至A172 細胞中，按照說明書操作檢測熒光活性。將anti-miR-con、antimiR-139-5p、miR-con、miR-139-5p 分別轉染至A172細胞中，Western 印跡檢測NPTX1 蛋白表達水平。

1.8 統計學分析 采用SPSS20.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同濃度七氟烷對膠質瘤細胞增殖的影響 與NC 組相比，不同濃度七氟烷處理膠質瘤細胞48 h、72 h后，細胞存活率顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 七氟烷對人腦膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響(,n=9)

表1 七氟烷對人腦膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響(,n=9)

與NC 組比較:1）P＜0.05；表2 同

2.2 人腦膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響 與NC組相比，不同濃度七氟烷組腦膠質瘤細胞遷移和侵襲數量顯著降低，MMP-9、MMP-2 表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表1、圖1、圖2。

圖1 Transwell 檢測膠質瘤細胞遷移和侵襲(結晶紫染色,×200)

圖2 Western 印跡檢測膠質瘤細胞MMP-2 和MMP-9 的表達

2.3 不同濃度七氟烷對膠質瘤細胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影響 與NC 組相比，不同濃度七氟烷組miR-139-5p 表達水平顯著升高，NPTX1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖3，表2。

圖3 Western 印跡檢測膠質瘤細胞NPTX1 的表達

表2 不同濃度七氟烷對膠質瘤細胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影響(,n=9)

表2 不同濃度七氟烷對膠質瘤細胞miR-139-5p 和NPTX1 蛋白的影響(,n=9)

2.4 miR-139-5p 靶向調控NPTX1 表達 starBase預測到NPTX1 與miR-139-5p 存在結合位點（圖4）。miR-139-5p 與WT-NPTX1 共轉染后細胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05，表3）。miR-139-5p 組NPTX1 表達水平顯著低于miR-con 組（0.21 ±0.03 vs 0.66±0.05；P＜0.05）；anti-miR-139-5p 組NPTX1 表達水平顯著高于anti-miR-con 組（1.17±0.13 vs 0.71±0.07，P＜0.05）。見圖5。

圖4 miR-139-5p 與NPTX1 存在靶向序列

圖5 miR-139-5p 調控NPTX1 蛋白表達

表3 熒光素酶活性(,n=9)

表3 熒光素酶活性(,n=9)

2.5 過表達NPTX1 逆轉了七氟烷對膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲的調控作用 與NC 組相比，Sevoflurane 組膠質瘤細胞活性和遷移和侵襲數量顯著降低，NPTX1、MMP-9、MMP-2 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與Sevoflurane+pcDNA 組相比，Sevoflurane+pcDNA-NPTX1 組膠質瘤細胞活性和遷移和侵襲數量顯著升高，NPTX1、MMP-9、MMP-2 表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖6、表4。

圖6 Western 印跡檢測膠質瘤細胞NPTX1、MMP-2 和MMP-9 的表達

表4 過表達NPTX1 逆轉了七氟烷對膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲的調控作用(,n=9)

表4 過表達NPTX1 逆轉了七氟烷對膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲的調控作用(,n=9)

與NC 組比較:1）P＜0.05；與Sevoflurane+pcDNA 組比較:2）P＜0.05；下表同

2.6 過表達NPTX1 逆轉了七氟烷對膠質瘤細胞EMT 的抑制作用 與Sevoflurane+pcDNA 組相比，Sevoflurane+pcDNA-NPTX1 組E-cadherin 表達水平顯著降低，Vimentin、N-cadherin 表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖7，表5。

圖7 Western 印跡檢測膠質瘤細胞E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 的表達

表5 過表達NPTX1 和七氟烷對膠質瘤細胞EMT 的影響(,n=9)

表5 過表達NPTX1 和七氟烷對膠質瘤細胞EMT 的影響(,n=9)

3 討論

七氟烷作為一種麻醉藥，其麻醉深度易調節、對循環抑制輕、呼吸道刺激小，有良好可控性，且有研究發現其對腦有一定的保護作用〔12，13〕。七氟烷可抑制低氧誘導的小鼠肺癌細胞侵襲和遷移能力〔14〕。七氟烷通過調控Wnt/β-catenin 信號通路影響MMP-2、MMP-9 蛋白水平，從而抑制乳腺癌MDAMB-231 細胞的侵襲、遷移能力〔15〕。七氟烷可通過下調MMP-2 和MMP-9 蛋白表達，進而抑制人結直腸癌HCT116 細胞的遷移和侵襲〔16〕。本實驗中七氟烷處理A172 細胞后，MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin 表達水平顯著降低，E-cadherin 表達水平顯著升高。MMP-2、MMP-9 屬于MMPs 家族，與細胞遷移和侵襲相關，Vimentin、N-cadherin、E-cadherin均是上皮間質轉化（EMT）的相關生物標志物，Vimentin、N-cadherin 低表達、E-cadherin 高表達抑制EMT〔17〕。說明七氟烷可能通過調控EMT 影響膠質瘤細胞遷移和侵襲。且有報道顯示七氟烷可促進人腦膠質瘤細胞A172 對替莫唑胺的敏感性〔18〕。本實驗結果顯示，七氟烷處理A172 細胞后，細胞存活率顯著降低，遷移和侵襲數量顯著降低。說明七氟烷可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。研究報道miR-139-5p 可通過調節Flt1 介導的Wnt/β-catenin通路抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲和EMT〔19〕。miR-139-5p 能通過靶向Notch1 抑制膠質瘤轉移和EMT〔20〕。NPTX1 是一種分泌蛋白，在人類多能干細胞（hPSCs）的神經誘導中迅速上調〔21〕。NPTX1 高甲基化與肺癌總體生存率差相關〔22〕。miR-128-3p通過靶向NPTX1 抑制膠質瘤細胞增殖〔23〕。本實驗結果顯示，此外，七氟烷處理A172 細胞后，miR-139-5p 表達水平顯著升高，NPTX1 表達水平顯著降低。miR-139-5p 可靶向調控NPTX1，過表達NPTX1 逆轉了七氟烷對膠質瘤細胞的作用。

綜上所述，七氟烷可通過調控miR-139-5p/NPTX1 抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲和EMT。