miR-335-5p 通過靶向調控GRK4 對ox-LDL 誘導的血管平滑肌細胞損傷的影響及其機制

黃威 饒艷玲 （ 武漢市第三醫院老年病科,湖北 武漢 430060; 武漢市第五醫院中醫科）

血管平滑肌細胞（VSMCs）是血管壁的主要組成細胞，通過舒張和收縮改變血管直徑使血管保持適當血壓，VSMCs 的衰老和DNA 氧化損傷是導致動脈粥樣硬化（AS）的重要因素，AS 又是導致大多數心臟病和腦卒中的主要原因〔1，2〕。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）主要由活性氧（ROS）生成增多并氧化修飾LDL 產生，可與多種受體結合造成脂質聚積，形成泡沫細胞，還具有損傷血管內皮細胞、促進VSMCs 增殖、遷移及炎性細胞因子釋放等作用，參與、促進了AS 的發生和發展〔3〕。近年來發現miRNAs 參與心血管生理、病理過程的調控并且通過調節血管活性分子、細胞因子等調節VSMC 細胞的功能，在血管損傷、重塑相關疾病中具有重要調節作用，是心血管疾病中的重要調控因子〔4〕。miR-335-5p 在敗血癥小鼠模型中表達下調，過表達的miR-335-5p 通過激活腺苷單磷酸激活蛋白激酶（AMPK）/自噬激活激酶（ULK）1 信號通路靶向脂肪酸合成酶（FASN）調節內皮細胞中的促凋亡因子和抗細胞凋亡因子，促進自噬，減少細胞凋亡，促進內皮細胞進入細胞周期，從而減輕膿毒癥小鼠模型的炎癥反應〔5〕。G 蛋白耦聯受體激酶（GRK）4 屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，可通過調節膜蛋白受體而發揮多種生物學作用，研究發現GRK4 與VSMC 的功能調節有關，GRK4 在ox-LDL 刺激的VSMC 中高表達，干擾GRK4，平滑肌細胞增殖減弱〔6〕。但miR-335-5p 對ox-LDL 誘導的VSMCs 損傷的影響及是否用過調控GRK4 影響平滑肌細胞損傷還尚未清楚。本實驗旨在研究miR-335-5p 對ox-LDL 誘導的VSMCs 損傷的作用及其機制，為AS 的預防和治療提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人主動脈血管平滑肌細胞HA-VSMC購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM 培養基、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Sigma公司；ox-LDL 購自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000 轉染試劑盒購自美國Invitrogen 公司；Trizol 試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio 公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自上海聯科生物技術有限公司；RIPA 蛋白裂解液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 使用含10% 胎牛血清的DMEM 培養基于37℃、5% CO2條件下培養HAVSMC，每天換液一次，將融合至80%左右的細胞適量胰酶消化并重懸細胞，調整濃度為5×105個/ml，取100 μl 接種至96 孔板，加入終濃度為50 mg/ml的ox-LDL，然后在37℃、5% CO2條件下培養48 h，收集細胞備用，作為ox-LDL 處理組，以不添加ox-LDL 培養的細胞作為對照（Con）組。將miR-NC、miR-335-5p、anti-miR-NC、anti-miR-335-5p 分別轉染至未經任何處理的HA-VSMC 細胞中，記為miR-NC組、miR-335-5p 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-335-5p組。用含50 mg/ml ox-LDL、5% 胎牛血清的DEME培養基培養HA-VSMC 細胞1 h，然后按照Lipofectamine 轉染試劑說明書將miR-NC、miR-335-5p、si-NC、si-GRK4 質粒分別轉染至HA-VSMC 細胞中再培養24 h，分別記為ox-LDL+miR-NC 組、ox-LDL+miR-335-5p 組、ox-LDL+si-NC 組、ox-LDL+si-GRK4組。將miR-335-5p 分別與pcDNA、pcDNA-GRK4 共轉染至ox-LDL 處理的細胞中再培養24 h，分別記為ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 組、ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA-GRK4 組。每組設3 個重復。

1.2.2 qRT-PCR 檢測miR-335-5p 和GRK4 mRNA表達水平 提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa 反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin 為內參進行PCR 擴增，每個樣品設3 個復孔，循環條件為95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40 個循環；72℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3 Western 印跡檢測蛋白表達 收集各組細胞，加入RIPA 裂解液裂解，4℃，10 000 r/min 離心15 min，收集蛋白上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE 后轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗（1 ∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3 次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3 次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化各組細胞，離心收集各組細胞，PBS 漂洗2 次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育15 min。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm 處的熒光強度。實驗重復3 次。

1.2.5 ELISA 檢測白細胞介素（IL）-1β 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 的表達 取各組細胞，離心取上清，然后按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-335-5p 對GRK4 的靶向調控 TargetScan 數據庫顯示GRK4 3＇UTR 區域有miR-335-5p 結合位點。構建野生型和突變型基因靶點GRK4 的3＇UTR-熒光素酶表達載體（WT-GRK4 和MUT-GRK4），取對數生長期血管平滑肌細胞接種于24 孔板（5×104個/孔），待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-GRK4 和MUT-GRK4 組細胞分別轉染miRNC 和miR-335-5p。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla 活性的比值進行統計學分析。實驗重復3 次。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結果

2.1 ox-LDL 處理對HA-VSMC 細胞中miR-335-5p和GRK4 表達的影響 與Con 組相比，ox-LDL 組細胞中miR-335-5p 的表達水平顯著降低，GRK4 mRNA 及蛋白的表達水平顯著升高（均P＜0.001）。見圖1，表1。

表1 ox-LDL 處理對HA-VSMC 細胞中miR-335-5p 和GRK4 表達的影響(,n=9)

表1 ox-LDL 處理對HA-VSMC 細胞中miR-335-5p 和GRK4 表達的影響(,n=9)

圖1 GRK4 蛋白表達

2.2 miR-335-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC細胞炎癥因子表達的影響 與Con 組相比，ox-LDL組miR-335-5p 的表達水平顯著降低；與ox-LDL+miRNC 組相比，ox-LDL+miR-335-5p 組miR-335-5p 的表達水平顯著升高（P＜0.05）。與Con 組相比，ox-LDL組IL-1β 和TNF-α 的表達水平顯著升高；與ox-LDL+miR-NC 組相比，ox-LDL+miR-335-5p 組IL-1β 和TNF-α 的表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 miR-335-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC 細胞炎癥因子表達及凋亡的影響(,n=9)

表2 miR-335-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC 細胞炎癥因子表達及凋亡的影響(,n=9)

與Con 組比較:1）P＜0.05；與ox-LDL+miR-NC 組比較:2）P＜0.05

2.3 miR-335-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HAVSMC 細胞凋亡的影響 與Con 組相比，ox-LDL 組Bcl-2 表達水平及凋亡率顯著降低，Bax、cleavedcaspase3 表達水平顯著升高；與ox-LDL+miR-NC 組相比，ox-LDL+miR-335-5p 組Bcl-2 表達水平顯著升高，Bax、cleaved-caspase3 表達水平及凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表2、圖3。

圖2 凋亡相關蛋白表達

圖3 細胞凋亡流式圖

2.4 抑制GRK4 表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC細胞損傷的影響 與ox-LDL+si-NC 組相比，ox-LDL+si-GRK4 組Bcl-2 表達水平顯著升高，Bax、cleaved-caspase3、GRK4 表達水平、細胞凋亡率、IL-1β、IFNα 水平均顯著降低（P＜0.05）。見表3、圖4。

圖4 GRK4 和凋亡相關蛋白的表達

表3 抑制GRK4 表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC 細胞損傷的影響(,n=9)

表3 抑制GRK4 表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC 細胞損傷的影響(,n=9)

與Con 組比較:1）P＜0.05；與ox-LDL+si-NC 組比較:2）P＜0.05

2.5 miR-335-5p 靶向調控GRK4 的表達 通過TargetScan 數據庫預測到GRK4 與miR-335-5p 存在結合位點（圖5）。熒光素酶報告基因檢測實驗結果（表4）顯示，相較于miR-NC 組，miR-335-5p 組WTGRK4 熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；MUTGRK4 熒光素酶活性差異不顯著。相較于miR-NC組，miR-335-5p GRK4 蛋白的表達水平顯著降低（0.46±0.04 vs 0.23±0.02，P＜0.05）；相較于antimiR-NC 組，miR-335-5p 組GRK4 蛋白的表達水平顯著升高（0.44±0.04 vs 0.94±0.08，P＜0.05）。見圖6。

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

圖5 GRK4 的3′UTR 中含有與miR-335-5p 互補的核苷酸序列

圖6 GRK4 蛋白表達

2.6 GRK4 過表達逆轉了miR-335-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC 細胞損傷的作用 與ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 組相比，ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA-GRK4 組Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax、cleaved-caspase3、GRK4 表達水平、凋亡率、IL-1β、TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05）。見圖7、表5。

圖7 GRK4 和凋亡相關蛋白的表達

表5 GRK4 過表達逆轉了miR-335-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC 細胞損傷的作用(,n=9)

表5 GRK4 過表達逆轉了miR-335-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HA-VSMC 細胞損傷的作用(,n=9)

與ox-LDL+miR-NC 組比較:1）P＜0.05；與ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 組比較:2）P＜0.05

3 討論

內皮細胞損傷等所導致的分泌功能失調和平滑肌細胞的異常增殖而引起的血管腔狹窄和痙攣是多種血管疾病發生發展的共同病理基礎〔7〕；AS 是一種脂質代謝與炎癥性血管疾病，炎癥在AS 發生發展中的作用越來越受到廣泛關注，有報道發現ox-LDL可以通過觸發炎癥反應，促進AS 的發生、形成〔8〕。TNF-α 和IL-1β 是與AS 有關的炎性細胞因子，能夠促進血管炎癥發生〔9〕。研究發現促炎因子IL-1β 和TNF-α 在ox-LDL 誘導的VSMCs 中mRNA 水平大大提高，苦參堿在抑制它們的表達后抑制了VSMCs 增殖和凋亡〔10〕。TNF-α 和IL-1β 下調表達，可減弱炎癥反應，延緩慢性牙周炎發展〔11〕。本研究結果顯示在ox-LDL 誘導的血管平滑肌細胞中TNF-α 和IL-1β 下均高表達，ox-LDL 促進VSMC 細胞的凋亡。而VSMC的凋亡和增殖失衡促進AS 的發生發展〔12〕。

miRNA 參與調控血脂代謝、血管炎癥、血管內皮細胞及VSMCs 與AS 發病機制相關〔13〕。研究表明，miR-335-5p 在骨關節炎患者的外周血單核細胞中下調表達，可能是骨關節炎的保護基因〔14〕。高糖狀態下，miR-335-5p 表達水平下調，高表達通過抑制DKK1 的蛋白表達，從而促進MC3T3-E1 成骨細胞的增殖，抑制細胞凋亡〔15〕。本研究發現在ox-LDL 誘導的血管平滑肌細胞中miR-335-5p 低表達，過表達miR-335-5p 炎癥因子TNF-α、IL-1β 釋放減少，細胞凋亡率降低。說明過表達miR-335-5p 可保護ox-LDL 誘導的血管平滑肌細胞損傷。

GRK4 是GRK 家族的一員，廣泛存在于各種組織，能特異地磷酸化G 蛋白耦聯受體（GPCRs）使其脫敏，從而使受體介導的信號轉導效應消失或者降低，且還能介導炎性介質所致細胞損傷的信號轉導作用，GRKs 磷酸化GPCR 在炎癥誘導細胞損傷過程中起一定調控作用〔16〕。GRK4 通過對內皮素B 型受體的異常調節，參與了原發性高血壓發生與發病〔17〕。GRK4 還可以誘導細胞衰老〔18〕。GRK4 能夠調控大鼠胸主動脈平滑肌細胞AT 受體蛋白表達及其磷酸化狀態，影響心血管相關疾病〔19〕。GRK4上調腎臟AT1 受體表達，增加了腎臟氧化應激水平和腎小管細胞凋亡，加重了腎臟缺血再灌注損傷〔20〕。本研究中ox-LDL 能促進HA-VSMC 細胞中GRK4 表達，抑制表達GRK4 炎癥因子TNF-α、IL-1β釋放減少，細胞凋亡率降低。說明且GRK4 低表達可以保護ox-LDL 引起的血管平滑肌細胞損傷。且本研究還發現miR-335-5p 靶向調控GRK4 的表達，GRK4 過表達逆轉了miR-335-5p 過表達對ox-LDL誘導的HA-VSMC 細胞損傷的作用。提示，miR-335-5p可能通過調控GRK4 進而影響炎性因子TNF-α、IL-1β的表達而發揮保護血管平滑肌細胞損傷的作用。

綜上所述，miR-335-5p 通過抑制GRK4 的表達和TNF-α、IL-1β 的分泌對ox-LDL 能夠誘導HAVSMC 細胞損傷發揮保護作用。可為AS 及VSMCs損傷導致的相關心血管疾病的預防和治療提供新思路和新靶點。