LncRNA ZFAS1 通過靶基因miR-432-5p 調控肺癌細胞增殖、侵襲和遷移的分子機制

彭勝利 肖婷 彭開利 謝碧容 （ 武漢市金銀潭醫院內科,湖北 武漢 43003; 武漢市蔡甸中醫院）

肺癌主要包括非小細胞肺癌與小細胞肺癌兩種病理類型，其中非小細胞肺癌占據較大比例，其具有較高的發病率與死亡率，目前臨床治療肺癌已取得一定進展但患者預后較差〔1〕。肺癌早期無明顯臨床特征，患者確診時已處于肺癌晚期，而腫瘤細胞遷移及侵襲是導致肺癌患者高死亡率的主要原因〔2〕。由于肺癌發病機制尚未完全闡明導致臨床缺乏行之有效的治療手段，因而尋找與肺癌細胞增殖、遷移及侵襲相關的基因或蛋白均可為肺癌治療提供新靶點。長鏈非編碼RNA（LncRNA）異常表達可調控腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等生物學過程，研究顯示在非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中均發現LncRNA 表達升高或降低均可影響腫瘤發生及發展進程〔3〕。LncRNA 鋅指結構反義轉錄本（LncRNA ZFAS）1 在非小細胞肺癌患者中高表達并與患者不良預后相關，但關于其在非小細胞癌發生及發展過程中的可能作用機制尚未完全闡明〔4〕。研究表明ZFAS1 還可促進透明細胞腎細胞癌、黑色素瘤、宮頸癌等多種惡性腫瘤發生及發展〔5〕。利用生物信息學網站預測ZFAS1 可能作用于微小RNA-432-5p（miR-432-5p），研究顯示miR-432-5p 在乳腺癌、肺癌及肝癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達并可發揮抑癌作用〔6，7〕。然而，ZFAS1 是否通過靶向調控miR-432-5p 的表達影響肺癌發生及發展尚未研究，本研究主要探討ZFAS1 對肺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，并初步分析其是否通過調控miR-432-5p 而發揮作用，可為肺癌靶向治療提供潛在作用靶點，有助于提高肺癌患者生存率并改善患者預后。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺癌細胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 均購自上海細胞生物研究所；人正常肺上皮細胞株BEAS-2B 購自上海酶研生物科技有限公司。miR-432-5p mimic、miR-432-5p 抑制劑（anti-miR-432-5p）、ZFAS1 siRNA（si-ZFAS1）及其各自陰性對照質粒均購自美國Invitrogen 公司；DMEM 培養基、胎牛血清均購自美國Gibco 公司；LipofectamineTM2000 轉染試劑盒購自美國ThermoFisher 公司；Trizol、反轉錄試劑盒及SYBR PCR Master Mix 試劑盒均購自北京寶日醫生物技術有限公司；MTT 檢測試劑盒購自百奧萊博科技有限公司；兔抗人基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgGⅡ抗體、兔抗人細胞周期素（CyclinD1）單克隆抗體均購自美國Abcam公司；兔抗人CyclinE 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；Transwell 小室、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均購自美國Millipore 公司；基質膠購自美國Coring 公司；電化學發光（ECL）試劑盒購自英國Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組 肺癌細胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 與正常肺上皮細胞株BEAS-2B 均常規培養于含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM 培養液中，培養條件為溫度37℃、CO2體積分數5%、相對濕度95%，每隔1 d 更換1 次培養液，培養3 d 后進行傳代，收集對數生長期細胞用于后續研究。ZFAS1 轉染處理及分組:采用脂質體瞬時轉染技術在A549 細胞中分別轉染ZFAS1 siRNA及其陰性對照質粒（si-con）分別為si-ZFAS1 組、sicon 組；進一步驗證ZFAS1 靶向調控miR-432-5p 的表達，在A549 細胞中分別轉染pcDNA-ZFAS1、si-ZFAS1 及其各自陰性對照，分別為pcDNA-ZFAS1組、si-ZFAS1 組、pcDNA 組、si-con 組。miR-432-5p轉染處理及分組:在A549 細胞中分別轉染miR-432-5p mimic、miR-con，分別為miR-432-5p 組、miRcon 組。為驗證ZFAS1 是否通過靶向調節miR-432-5p 表達而發揮作用，分別將si-ZFAS1 與anti-miRcon、anti-miR-432-5p 共同轉染入A549 細胞，分別為si-ZFAS1+anti-miR-con 組、si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 組。轉染條件為:轉染前1 d 更換為不含胎牛血清及雙抗的DMEM 培養基，轉染后6 h 更換為含胎牛血清及雙抗的新鮮DMEM 培養基，繼續放入恒溫培養箱培養48 h，收集細胞用于后續實驗研究。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞中LncRNA ZFAS1、miR-432-5p 表達水平用Trizol 試劑提取H1299、A549、SPC-A-1、NCH446、BEAS-2B 細胞及轉染后各組A549 細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA 反轉錄為cDNA 并將其用于qRT-PCR，配制反應體系為20 μl，包括2 μl cDNA，LncRNA ZFAS1、miR-432-5p 正反向引物各0.8 μl，10 μl/孔SYBR Premix Ex Taq（2×），ddH2O 6 μl/孔，ROX 0.4 μl/孔。配制體系后將其置于實時熒光定量PCR 儀進行擴增反應，反應條件為95℃2 min 循環1 次，95℃15 s，60℃60 s，72℃30 s 循環40 次。ZFAS1 以GAPDH 為內參基因，miR-432-5p 以U6 為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算ZFAS1、miR-432-5p 相對表達量。

1.2.3 Western 印跡檢測CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達 收集各組細胞，用預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，加入100 μl 蛋白裂解液，細胞裂解物經4℃條件下12 000 r/min 轉速離心10 min，吸取上清并用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，加入十二烷基硫酸鈉（SDS）-上樣緩沖液在100℃恒溫水浴鍋內孵育5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白并轉移至PVDF 膜，脫脂牛奶封閉2 h 后，分別加入CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白一抗（1 ∶500），TBST 洗滌，4℃條件下加入二抗（1 ∶5 000）孵育2 h，TBST 洗膜，用ECL 試劑盒進行顯影反應，應用凝膠分析系統及Image J 圖像分析軟件對各條帶灰度值進行定量分析。

1.2.4 熒光素酶報告基因實驗 應用生物信息網站預測ZFAS1 與miR-432-5p 的結合片段，利用PCR擴增ZFAS1 基因序列上二者結合片段，將結合片段插入pMIR-REPORT 載體中構建野生型WT-ZFAS1質粒，利用基因突變技術將結合位點進行突變構建MUT-ZFAS1 突變質粒，分別用WT-ZFAS1 質粒、MUT-ZFAS1 突變質粒與miR-432-5p mimic 分別或同時對A549 細胞進行轉染，參照雙熒光素酶報告基因試劑盒對各組細胞熒光素酶活性進行檢測，各組實驗均重復3 次。

1.2.5 MTT 檢測細胞增殖 收集對數生長期A549細胞，胰蛋白酶消化，調整細胞濃度為1×104個細胞/ml，以200 μl/孔接種于96 孔板，每組均設置3個復孔，分別在轉染后24 h、48 h、72 h 以20 μl/孔加入MTT 溶液（濃度為5 mg/ml），置于37℃、CO2體積分數5%、相對濕度95% 的培養箱繼續培養4 h，棄MTT 液，以150 μl/孔分別加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻，利用酶標儀檢測各孔吸光度（OD490）值。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細胞遷移 用不含胎牛血清的DMEM 培養液收集“1.2.1”中各組對數生長期A549 細胞，接種于Transwell 小室的上室（細胞密度為1×105個細胞/孔），Transwell 小室的下室加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養基（500 μl），繼續培養12 h，取出Transwell 小室并用棉簽刮取Transwell 小室上層細胞，甲醇（100%）固定30 min，用PBS 洗滌后結晶紫染色15 min，將其放入顯微鏡下隨機選取5 個視野觀察遷移細胞數。實驗均設置3 次重復。

1.2.7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲 按照細胞遷移實驗收取細胞并進行相同處理，預先用無血清DMEM 培養基稀釋基質膠，稀釋至濃度為1 mg/μl，分別取60 μl 稀釋后的基質膠置于Transwell 小室底部的上室面，恒溫培養箱內培養30 min，同時將收取的細胞接種于Transwell 小室上室（1×104個細胞/孔），吸取含有10%胎牛血清的DMEM 培養基500 μl置于Transwell 小室的下室，刮出Transwell 小室上層細胞用100%甲醇固定，30 min 后用PBS 洗滌，結晶紫染色15 min，置于顯微鏡下觀察并隨機選取5 個視野計算侵襲細胞數。實驗均設置3 次重復。

1.3 統計學處理 采用統計學軟件SPSS22.0 進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 實 驗

2.1 肺癌細胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表達 qRT-PCR 檢測結果顯示（表1），與人正常肺上皮細胞株BEAS-2B 相比，人肺癌細胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446 中ZFAS1 表達水平顯著升高（P＜0.05），而miR-432-5p 表達水平顯著降低（P＜0.05），不同肺癌細胞系A549 細胞中ZFAS1 表達水平相對較高，而miR-432-5p 表達水平相對較低，因此選取A549 細胞為后續研究細胞。

表1 肺癌細胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表達(,n=3)

表1 肺癌細胞株中ZFAS1 和miR-432-5p 的表達(,n=3)

與BEAS-2B 比較:1）P＜0.05

2.2 干擾ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖的影響 與si-con組比較，si-ZFAS1組ZFAS1表達水平明顯降低（P＜0.05），表明轉染成功。與si-con 組比較，si-ZFAS1 組48、72 h 細胞OD 值明顯降低（P＜0.05），同時Western 印跡檢測結果顯示si-ZFAS1 組細胞CyclinE、CyclinD1 蛋白表達顯著下調（P＜0.05），見表2、圖1。表明干擾ZFAS1 表達可抑制肺癌細胞A549 增殖。

表2 下調ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖的影響(,n=3)

表2 下調ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖的影響(,n=3)

圖1 檢測肺癌細胞A549 增殖蛋白CyclinE 和CyclinD1 的表達

2.3 干擾ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 遷移和侵襲的影響 si-ZFAS1 組遷移及侵襲細胞數與si-con組比較明顯較少（P＜0.05）。與si-con 組比較，si-ZFAS1 組A549 細胞MMP-2、MMP-9 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見表3、圖2、圖3。表明干擾ZFAS1 表達可通過降低MMP-2、MMP-9 蛋白表達進而抑制A549 細胞遷移及侵襲。

表3 下調ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲及MMP-2、-9 蛋白表達的影響(,n=3)

表3 下調ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲及MMP-2、-9 蛋白表達的影響(,n=3)

圖2 檢測肺癌細胞A549 遷移和侵襲(結晶紫染色,×200)

圖3 Western 印跡肺癌細胞A549 轉移蛋白的表達

2.4 ZFAS1 靶向調控miR-432-5p 的表達 用生物信息預測檢測出ZFAS1 上存在miR-432-5p 結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗結果（圖4、表4）顯示，miR-432-5p mimic 可顯著降低野生型WT-ZFAS1質粒的熒光素酶活性（P＜0.05），但對突變型MUTZFAS1 質粒熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05）。表明ZFAS1 與miR-432-5p 之間存在靶向調控關系。qRT-PCR 實驗結果顯示，si-con 組、si-ZFAS1 組、pcDNA 組、pcDNA-ZFAS1 組，miR-432-5p 表達分別為:1.00±0.05、7.26±0.46、1.65±0.14、0.48±0.07，si-ZFAS1 組miR-432-5p 表達顯著高于si-con 組（P＜0.05），pcDNA-ZFAS1 組miR-432-5p 表達水平明顯低于pcDNA 組（P＜0.05）。表明ZFAS1 可負向調控miR-432-5p 表達。

圖4 ZFAS1 與miR-432-5p 互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=3)

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=3)

2.5 過表達miR-432-5p 對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲的影響 miR-432-5p 組A549 細胞miR-432-5p 表達水平顯著高于miR-con 組（P＜0.05），提示基因轉染技術能夠提高miR-432-5p 在肺癌細胞A549 細胞中的表達水平，可用于后續實驗研究。與miR-con 組比較，miR-432-5p 組48 h、72 h A549 細胞OD 值、遷移及侵襲細胞數均顯著降低（P＜0.05），Western 印跡實驗結果顯示細胞增殖、遷移及侵襲相關蛋白CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表達水平均顯著降低（P＜0.05），見圖5、表5。表明上調miR-432-5p 表達能夠通過下調CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達進而抑制肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲。

圖5 Western 印跡肺癌細胞A549 增殖和轉移蛋白的表達

表5 上調miR-432-5p 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲及CyclinE、D1 和MMP-2、-9 表達的影響(,n=3)

表5 上調miR-432-5p 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲及CyclinE、D1 和MMP-2、-9 表達的影響(,n=3)

2.6 沉默ZFAS1 表達和干擾miR-432-5p 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲的作用 MTT、Transwell 實驗結果顯示，si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 組A549 細胞48 h、72 h OD 值、遷移及侵襲細胞數均比si-ZFAS1+anti-miR-con 組明顯升高（P＜0.05），Western 印跡實驗結果顯示，與si-ZFAS1+anti-miRcon 組相比，si-ZFAS1+anti-miR-432-5p 組A549 細胞CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達均顯著上調（P＜0.05），見圖6、表6。表明干擾miR-432-5p表達可逆轉沉默ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

表6 干擾miR-432-5p 表達逆轉沉默ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲的抑制作用及Cyclin E、D1 和MMP-2、-9 表達(,n=3)

表6 干擾miR-432-5p 表達逆轉沉默ZFAS1 表達對肺癌細胞A549 增殖、遷移、侵襲的抑制作用及Cyclin E、D1 和MMP-2、-9 表達(,n=3)

與si-con 組比較:1）P＜0.05；與si-ZFAS1+anti-miR-con 組比較:2）P＜0.05

圖6 Western 印跡肺癌細胞A549 增殖和轉移蛋白的表達

3 討論

肺癌靶向治療研究取得一定效果但患者死亡率仍逐年升高，同時患者治療后死亡率仍未得到有效改善〔8〕。因此尋找肺癌早期診斷靶點及評估患者預后的有效分子標志物對降低患者死亡率具有重要意義。近年來LncRNA 在肺癌等多種惡性腫瘤中的表達及作用引起重視，其主要可通過競爭性吸附miRNA 而降低其表達水平進而參與腫瘤細胞生物學過程〔9，10〕。

ZFAS1 是近年來新發現的LncRNA，研究顯示ZFAS1 在肝細胞癌、胃癌等腫瘤細胞增殖及遷移過程中發揮重要調控作用〔11，12〕。鄭茁等〔13〕研究表明ZFAS1 在鼻咽癌組織中呈高表達并與患者臨床分期等臨床病理特征密切相關，同時可作為早期診斷及評估患者疾病進展的重要分子標志物。李彥儒等〔14〕研究表明ZFAS1 表達異常還與心力衰竭及心肌梗死等多種心血管疾病有關，同時乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤組織及細胞中ZFAS1 表達均明顯升高并可促進癌癥發生及發展。相關研究表明ZFAS1在非小細胞肺癌患者癌組織中表達水平升高，沉默ZFAS1 表達可誘導非小細胞肺癌細胞周期阻滯并通過抑制上皮-間質轉變進而抑制細胞增殖、遷移及侵襲〔15〕。本研究結果顯示ZFAS1 在肺癌細胞中均呈高表達，提示ZFAS1 可能在肺癌發生及發展過程中發揮促癌作用。通過siRNA 將肺癌A549 細胞中的ZFAS1 進行下調，腫瘤細胞增殖活性明顯降低，同時CyclinE、CyclinD1 蛋白表達均顯著降低，而細胞周期紊亂是導致肺癌發生及發展的重要原因，CyclinE、CyclinD1 是細胞周期蛋白激酶復合物并可調控細胞周期〔16〕，說明沉默ZFAS1 可通過抑制CyclinE、CyclinD1 蛋白表達影響細胞周期進而抑制肺癌A549 細胞增殖。同時本研究發現沉默ZFAS1 表達后A549 細胞遷移及侵襲細胞數均明顯減少，而MMP-2、MMP-9 蛋白表達均明顯降低，MMP-2、MMP-9 是MMPs 家族成員，其可通過降解細胞外基質進而促進腫瘤細胞遷移及浸潤〔17〕。說明沉默ZFAS1可通過抑制MMP-2、MMP-9 蛋白表達進而抑制肺癌細胞遷移及侵襲。提示ZFAS1 可能通過上調CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達進而促進肺癌A549 細胞增殖、遷移及侵襲。

miR-432 在骨肉瘤細胞中低表達，上調miR-432表達能夠靶向調控CX3C 趨化因子配體（CX3CL）1進而抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移及侵襲〔18〕。乳腺癌患者外泌體miR-432-5p 表達水平升高可增強患者對化療藥物的敏感性〔19〕。Rihani 等〔20〕研究表明miR-432-5p 在神經母細胞瘤中呈低表達并可促進腫瘤細胞凋亡，但關于其具體作用機制尚未可知。Li 等〔21〕研究表明LncRNA625 通過靶向miR-432 調節Wnt/β-連環蛋白信號通路進而促進前列腺癌細胞的增殖和凋亡。Chen 等〔22〕研究表明miR-432 通過靶向E2F 轉錄因子（E2F）3 和受體酪氨酸激酶（AXL）而抑制肺腺癌細胞增殖。然而，關于miR-432-5p 在肺癌發生及發展過程中的具體作用尚未完全闡明。本研究結果顯示miR-432-5p 在肺癌細胞中呈低表達，上調miR-432-5p 表達可有效抑制肺癌A549 細胞增殖、遷移及侵襲能力，同時本研究從生物信息學網站預測到miR-432-5p 與ZFAS1 有相似的結合序列位點，通過雙熒光素酶報告實驗檢測發現miR-432-5p 可影響ZFAS1 的熒光素酶活性，說明miR-432-5p 與ZFAS1 存在相互調控關系。沉默ZFAS1 的表達后miR-432-5p 的表達上調，ZFAS1 過表達后miR-432-5p 的表達下調，提示ZFAS1 可抑制miR-432-5p 的表達水平。通過anti-miR-432-5p 轉染si-ZFAS1 的A549 細胞，結果發現si-ZFAS1+antimiR-432-5p 組A549 細胞增殖、遷移、侵襲能力均得到明顯提高，同時CyclinE、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均明顯上調，說明ZFAS1 可靶向抑制miR-432-5p 的表達進而促進A549 細胞增殖、遷移及侵襲，抑制miR-432-5p 表達可在一定程度上增強ZFAS1 對A549 細胞增殖、遷移及侵襲的促進作用。提示沉默ZFAS1 表達可通過上調miR-432-5p 表達進而抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲，有望成為肺癌靶向治療的新型靶點。

綜上所述，ZFAS1 可調控miR-432-5p 表達而影響肺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，為揭示肺癌發生的分子機制及探索新型靶標基因提供依據。但本研究存在一定局限性，關于ZFAS1 在肺癌組織中的表達變化及其與患者預后的關系均需進一步研究，同時ZFAS1 與肺癌發生及發展過程相關信號通路的作用關系仍需深入探索。