丹參酮ⅡA 磺酸鈉對老年COPD 模型大鼠的治療作用及其機制

王志敏 林純意 易高

（廣州醫科大學附屬第五醫院 1 重癥醫學科,廣東 廣州 510700;2 呼吸內科）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種常見的以持續氣流受限為特征的慢性炎癥性肺部疾病，以肺彈性減小、氣道和肺泡結構改變引起缺氧和（或）二氧化碳潴留為主要特點〔1〕，主要累及肺實質、肺血管及氣道〔2〕。COPD 后期可繼發肺動脈高壓，具有很高的患病率及病死率〔3，4〕。研究顯示炎癥反應是COPD 發生的主要原因之一，炎癥細胞被激活后釋放大量炎癥因子浸潤氣道和肺組織，最終引起呼吸系統組織結構破壞，進一步參與COPD 的發生發展〔5〕。丹參酮ⅡA 磺酸鈉是從丹參中分離出二萜醌類化合物丹參酮后經磺化得到的水溶性物質，具有抗氧化、抗菌抗炎、抗凝血作用和抑制氣道重塑等多種生物活性〔6〕。本研究探討丹參酮ⅡA 磺酸鈉對老年COPD 模型大鼠的治療作用及其作用機制為其在臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠62 只，SPF 級，雄性，22～24 周齡，體重250～300 g，由廣東省動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK（粵）2013-0002。實驗開始前先適應性喂養1 w，動物房溫度23～27℃，相對濕度45%～55%，晝夜時間12 h/12 h，用標準大鼠顆粒飼料喂養，自由飲用純凈水。

1.1.2 主要藥物或試劑 丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業有限公司，國藥準字H31022558）；脂多糖（LPS，美國Sigma 公司），中南海牌過濾嘴香煙（北京卷煙廠:焦油含量12 mg，煙堿量1.0 mg，一氧化碳量13 mg），腫瘤壞死因子（TNF）-α 試劑盒、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8 和IL-18（武漢博士德生物工程有限公司）；TRIZOL 試劑、逆轉錄試劑盒、Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）試劑，由天根生化科技（北京）有限公司生產；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體（美國BD Biosciences 公司）；RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、兔抗鼠β-actin 抗體、HRP-羊抗大鼠IgG、ECL Prime 蛋白印跡試劑，均購自福州邁新生物技術開發有限公司。PI3K、AKT、mTOR 和內參β-肌動蛋白（β-actin）引物設計與合成由天根生化科技（北京）有限公司完成，引物序列見表1。

1.1.3 主要儀器 -80℃超低溫冰箱（青島海爾電冰箱有限公司），自制煙霧暴露裝置，Buxco 動物肺功能分析系統（北京華運安特科技有限責任公司），Thermo CL31R 型離心機（美國Thermo 公司），超微量分光光度計（北京凱奧科技公司），ABI step one熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），GeneGenius 全自動凝膠成像系統（美國Syngene 公司），Western 印跡電泳儀（美國BIO-RAD 公司），Fluor Chem Q 蛋白印跡成像和定量分析系統（美國Alpha 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 COPD 動物模型的制備 隨機選擇12 只大鼠作為正常對照組，其余50 只大鼠采用氣管注入LPS 和吸入香煙煙霧法制備COPD 模型。第1 天各大鼠經10%水合氯醛（100 g/0.25 ml）腹腔麻醉，氣管內注射1 mg/ml LPS 100 μl，以軸位旋轉大鼠數次。于第2～28 天將各大鼠在100 cm×80 cm×80 cm有機玻璃密閉箱進行煙熏，每次同時點燃香煙8 支，30 min/次，2 次/d。熏煙后立刻將大鼠移至15℃低溫環境，冷空氣刺激1 h，模型復制28 d 結束。造模結束后隨機取2 只做肺部病理切片，確認造模成功。

1.2.2 分組與給藥 造模結束時將COPD 大鼠按隨機數字表分為模型對照組、丹參酮ⅡA 大劑量組、中劑量組和小劑量組，每組各12 只，另未造模的12只大鼠作為正常對照組。丹參酮ⅡA 大劑量組、中劑量組和小劑量組分別腹腔內注射丹參酮ⅡA 磺酸鈉10.0 mg/kg、5.0 mg/kg 和2.5 mg/kg，正常對照組和模型對照組大鼠腹腔注射同體積的生理鹽水，1 次/d，共14 d。

1.2.3 檢測指標 末次給藥后1 h 測定各組大鼠肺功能、支氣管肺泡灌洗液中細胞計數、血清炎癥細胞因子水平、肺組織PI3K/AKT 信號通路基因和蛋白的表達。

1.2.3.1 肺功能測定 各組大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.3 ml/100 g 麻醉，仰臥位固定，暴露氣管，行氣管插管后與小動物肺功能檢查儀器的皮管聯接，測定各組大鼠肺功能指標，包括用力肺活量（FVC），第0.3 秒用力呼氣容積（FEV0.3）和最大呼氣流量（PEF），計算FEV0.3/FVC。

1.2.3.2 血清炎癥因子水平測定 肺功能測定結束后打開腹腔并暴露腹主靜脈。經腹主靜脈抽血1 ml，室溫下靜止至血液完全凝固后離心（3 000 r/min×10 min），采用雙抗體一步夾心法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平。具體操作嚴格按照說明書進行。

1.2.3.3 支氣管肺泡灌洗液細胞計數 各組大鼠脫臼處死，打開胸腔，分離氣管和雙肺。在氣管下部做橫切口，分別用止血夾關閉左、右主支氣管，通過氣管插管術收集肺泡灌洗液（BALF），用注射器分3次緩慢注入4℃冷PBS，2 ml/次，緩慢回吸收集BALF，回收液為80%～90%。BALF 于4℃下離心（3 000 r/min×10 min），然后用2 ml PBS 重懸細胞沉淀，采用血細胞計數板進行細胞計數，并經Wright染色對中性粒細胞和巨噬細胞進行分類計數。

1.2.3.4 RT-PCR 測定肺組織PI3K/AKT 信號通路基因的表達 取右肺后葉及副葉在液氮中研磨，加Trizol 試劑提取總RNA，用逆轉錄試劑盒合成得cDNA。逆轉錄體系:10 mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1 μl，隨機引物2 g，5×緩沖液4 μl，二硫蘇糖醇（DTT，100 mmol/L）2 μl，核糖核酸酶抑制劑（RNAsin）1 μl，莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶（MMLVRT）反轉錄酶1 μl。逆轉錄條件:37℃50 min，70℃15 min。將所得cDNA 于-80℃保存。進行PCR 前先將cDNA 室溫下解凍，純化后進行PCR 擴增。PCR 體系:cDNA 模板2 μl，目標基因上游引物和下游引物各2 μl，Super Real Pre Mix Plus 10 μl，加入純化H2O 至20 μl。PCR 條件:95℃預變性10 s，然后以95℃10 s、90℃5 s、60℃20 s、40 個循環。以β-actin 為內參基因，采用2-ΔΔCt計算目標基因PI3K、AKT、mTOR 的相對表達量。

1.2.3.5 Western 印跡測定肺組織PI3K/AKT 信號通路蛋白的表達 取左肺后葉及副葉，切成米粒大小，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，使肺組織裂解，于4℃離心（12 000 r/min×10 min），分離得可溶性蛋白，用BCA 法進行蛋白定量，于-20℃保存。進行測量前先將蛋白室溫下解凍，100℃變性10 min。取10 μl 上樣，用10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，轉膜。用5%脫脂奶粉（磷酸化抗體用4% BSA）封閉2 h，分別加入PI3K、AKT、mTOR 和β-actin 一抗，4℃下孵育過夜。PBST 溶液洗膜3 次，加入IgG-HRP，室溫避光孵育1 h，PBST 溶液洗膜3 次。加ECL 液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.2.4 統計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 各組肺功能比較 模型對照組大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均較正常對照組顯著降低（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型對照組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 差異均無統計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組FVC、FEV 0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著升高（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC 和PEF 均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著升高（P＜0.05）。見表2。

2.2 各組BALF 細胞計數比較 模型對照組BALF細胞總數、中性粒細胞和巨噬細胞均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型組BALF 細胞總數、中性粒細胞和巨噬細胞計數差異均無統計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組BALF 細胞總數、中性粒細胞和巨噬細胞計數均較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組BALF 細胞總數、中性粒細胞和巨噬細胞計數均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組肺功能指標和BALF 細胞計數的比較(,n=12)

表2 各組肺功能指標和BALF 細胞計數的比較(,n=12)

與正常對照組比較:1）P＜0.05；與模型對照組比較:2）P＜0.05；與丹參酮ⅡA 小劑量組比較:3）P＜0.05；與丹參酮ⅡA 中劑量組比較:4）P＜0.05；下表同

2.3 各組血清炎癥因子水平的比較 模型對照組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型對照組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平差異均無統計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA中劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組血清炎癥因子水平的比較(,n=12,ng/L)

表3 各組血清炎癥因子水平的比較(,n=12,ng/L)

2.4 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路基因表達水平的比較 模型對照組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表達水平均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA 表達水平較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR mRNA表達水平均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組和中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表4。

2.5 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路蛋白表達水平的比較 模型對照組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平均較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 小劑量組和模型組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05），丹參酮ⅡA 中劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平均較模型對照組和丹參酮ⅡA 小劑量組顯著降低（P＜0.05），丹參酮ⅡA 大劑量組肺組織PI3K、AKT1 和mTOR 蛋白表達水平均較模型對照組、丹參酮ⅡA 小劑量組中劑量組顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路基因及蛋白表達水平的比較(,n=12)

表4 各組肺組織PI3K/AKT 信號通路基因及蛋白表達水平的比較(,n=12)

3 討論

COPD 的發病原因及其致病機制目前還不十分明確，吸煙是目前公認COPD 的最主要病因。煙草燃燒產生的有害顆粒及氧化物質能直接損傷支氣管黏膜纖毛系統，引起支氣管痙攣，削弱呼吸道的防御能力和自凈能力，并且可活化肺組織中炎癥細胞，使其釋放包括基質金屬蛋白酶在內的多種蛋白酶類、大量氧自由基、氧化產物和多種炎癥因子。炎癥因子可促進肺組織損傷及氣道重塑。大量氧自由基和氧化產物使得細胞外基質過多破壞降解，彈性纖維斷裂，逐漸破壞形成肺氣腫〔7，8〕。上述細胞和炎癥因子共同作用導致肺部慢性炎癥的產生，最終使肺部結構改變〔9〕。丹參酮ⅡA 磺酸鈉具有抗氧化，降低血液黏度以抑制凝血、促進纖溶、抑制血小板聚集、延長血栓形成及促進血栓溶解作用等。近年來關于丹參酮ⅡA 磺酸鈉的抗炎特性越來越受到關注，并且在抑制組織重塑、凋亡、血管新生等方面具有一定作用〔10〕。已有關于丹參酮ⅡA 磺酸鈉對COPD 治療作用的研究〔6，11〕，但是對老年COPD 的治療作用卻未見報道。本研究結果顯示，丹參酮Ⅱ磺酸鈉可顯著改善老年COPD 大鼠的呼吸功能。

目前大多認為COPD 為慢性持續性炎癥性氣道疾病，而巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞等是COPD 炎癥的主要參與細胞。機體發生COPD 時，肺不同部位的肺泡巨噬細胞、T 淋巴細胞和中性粒細胞表達增加，對各級支氣管系統的浸潤，聚集在支氣管周圍的炎癥細胞被激活釋放大量炎癥因子〔12〕，對氣道結構細胞和促進中性粒細胞炎癥反應均產生重要影響。因此，計數BALF 中炎癥細胞數量可間接評估COPD 嚴重程度。本研究結果說明丹參酮Ⅱ磺酸鈉對老年COPD 大鼠的治療作用可能與其降低肺組織炎癥細胞有關。

炎癥因子在COPD 的炎癥反應中發揮重要作用。TNF-α 具有較強的抗病毒、抗腫瘤、免疫調節及炎癥誘導作用〔13〕。IL-1β 主要由白細胞特產生，參與機體炎癥反應、免疫應答。同時，IL-1β 還可與其他炎性物質相互誘導、共同作用，募集并激活炎性細胞〔14〕，引起其他炎性物質的產生〔15〕。IL-6 主要由單核-巨噬細胞、B 淋巴細胞和T 淋巴細胞、成纖維細胞和內皮細胞等分泌，與多種組織、細胞有親和力，能夠調節免疫應答、參與炎癥反應的功能〔16〕。IL-8 主要由單核巨噬細胞產生，可促使中性粒細胞活化和遷移，釋放炎癥介質，可直接導致組織受到損害〔17〕。IL-18 主要由巨噬細胞分泌，在對病原體天然免疫的防御中起重要作用。IL-18 可誘導中性粒細胞并聚集至氣管、支氣管及肺組織，并產生氧自由基和水解酶，不斷加劇支氣管和肺內的炎癥作用，最后導致COPD 發生〔18〕。本研究結果顯示，丹參酮Ⅱ磺酸鈉可劑量依賴性降低老年COPD 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-18 水平，說明丹參酮Ⅱ磺酸鈉對老年COPD 大鼠的治療作用可能與其降低上述炎癥因子水平有關。

PI3K/AKT 信號通路是細胞內參與細胞炎癥、凋亡和自噬等經典信號通路，參與COPD 的發展。PI3K 是一種可催化磷脂酰肌醇磷酸化的脂類激酶，AKT 是進化上高度保守的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是AKT 下游眾多的靶因子之一。激活PI3K 后使磷脂酰肌醇磷酸化，募集AKT 和PDK1 絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化AKT 并激活mTOR，導致內皮細胞增殖和分化，促進上皮細胞間質轉化〔19〕。香煙煙霧可誘導PI3K/AKT 磷酸化增加，導致COPD 患者小氣道纖維化〔20〕。本研究結果說明丹參酮Ⅱ磺酸鈉對老年COPD 大鼠的治療作用可能與其調節肺組織PI3K/AKT 信號通路基因和蛋白的表達有關。

綜上，丹參酮ⅡA 磺酸鈉可顯著改善老年COPD 大鼠的肺功能，其作用可能與其降低機體炎癥反應、調節PI3K/AKT 信號通路基因和蛋白的表達有關。