白花丹素通過調控Wnt 信號通路抑制肝癌MHCC97-H 細胞增殖、遷移和侵襲

郭麗 趙虹 張俊濤 劉志貞 弓韜 于保鋒

（1 臨汾職業技術學院,山西 臨汾 041000;2 山西醫科大學生物化學與分子生物學教研室）

肝癌分為原發性和繼發性兩大類，其中原發性肝癌最為常見。肝細胞癌屬于原發性肝癌，占所有肝癌病例的90%以上。肝癌在世界范圍內具有較高的患病率，是全球癌癥相關死亡率的第三大原因〔1〕。肝癌具有高度侵襲性、高復發率及高死亡率等特征，導致患者預后不良〔2〕。目前肝癌的治療主要包括外科手術、放療和化療等綜合治療方式，但患者5 年生存率仍不能令人滿意〔3〕。考慮到傳統化療和放療的細胞毒性及對患者的毒副作用，因此亟需尋找低毒、高效且毒副作用較小的藥物用于肝癌的治療。近幾十年來，中藥在腫瘤治療中展現出其獨特的優勢，已受到廣大學者的廣泛關注〔4〕。白花丹素（PLB）是從天然中藥白花丹根部提取的有效活性成分，具有抗炎、鎮痛、消腫等多種藥理學功能。近期研究發現，白花丹素在抗腫瘤中扮演重要角色，包括前列腺癌、乳腺癌和舌鱗狀細胞癌等〔5，6〕。目前尚未有報道闡明PLB 對肝癌MHCC97-H 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制。Wnt 信號通路是機體中重要的信號轉導通路，在多種疾病中發揮重要作用，包括腫瘤〔7〕。研究顯示，Wnt 信號通路的異常激活與肝癌的發生和發展密切相關〔8〕。因此，本研究旨在探究PLB 對人肝癌MHCC97-H 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及對Wnt 信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 人肝癌MHCC97-H 細胞株（中國科學院上海細胞庫）；PLB、Wnt 激活劑氯化鋰（LiCl，美國Sigma 公司）；DMEM 培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；胰蛋白酶（美國Corning Cellgro 公司）；CCK-8 試劑（日本同仁化學研究所）；孔徑為8 μm 的Transwell 小室、基質膠（美國BD 公司）；除抗體外Western 印跡檢測所需試劑（上海碧云天生物技術研究所）；基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；Wnt1、β-連環蛋白（β-catenin）和生存素（Survivin）抗體及二抗（美國CST 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌MHCC97-H 細胞復制后培養在含10%胎牛血清的DMEM 培養液中，放置在飽和濕度、體積分數為5%CO2、37℃恒溫培養箱中，每隔2 d 更換1 次新的培養液，待MHCC97-H 細胞呈單層鋪滿培養瓶底90%以上時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，以1 ∶3的比例進行傳代，取生長狀態良好的MHCC97-H 細胞用于后續研究。

1.2.2 CCK-8 法檢測PLB 對MHCC97-H 細胞增殖的影響 對數生長期的MHCC97-H 細胞消化后計數，調整細胞濃度為5×104個/ml，取200 μl 細胞懸液接種到96 孔板中，置37℃恒溫培養箱常規培養，待細胞貼壁后除去舊培養液，更換成含不同濃度（0.0、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L）PLB 的培養液，其中0.0 μmol/L 設為空白對照（Blank 組），于37℃培養箱分別孵育24、48、72 h，每個濃度的每個時間點設置3 個復孔，在各個時間點向各孔細胞中加入10 μl CCK-8 溶液，繼續孵育4 h，使用酶標儀測定波長在450 nm 處細胞的吸光度值，分別計算PLB 對MHCC97-H 細胞增殖抑制率和干預48 h 半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 細胞分組 將對數增殖期的MHCC97-H 細胞隨機分為4 組:Blank 組、PLB 組、激活劑（LiCl）組和PLB+激活劑（PLB+LiCl）組。Blank 組MHCC97-H 細胞不作任何處理；PLB 組MHCC97-H 細胞以終濃度為4 μmol/L PLB 干預48 h；LiCl 組MHCC97-H細胞以濃度為20 nmol/L Wnt 激活劑LiCl 干預48 h；PLB+LiCl 組MHCC97-H 細胞以 終濃度 為4 μmol/L PLB 和濃度為20 nmol/L LiCl 干預48 h。

1.2.4 克隆形成實驗檢測MHCC97-H 細胞克隆形成能力 對數期的MHCC97-H 細胞按1.2.3 方法分組和處理后，以胰蛋白酶消化，按5×102/孔均勻的種植在6 孔板中，常規培養，每3 d 更換1 次新的培養液，14 d 后取出6 孔板，細胞用95%乙醇固定30 min，隨后用4 g/L 結晶紫染色15 min，用蒸餾水洗去染液，風干后統計每孔中細胞克隆形成數，分別計算各組MHCC97-H 細胞克隆形成率，克隆形成率（%）=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.2.5 Transwell 實驗檢測MHCC97-H 細胞侵襲能力 Matrigel 基質膠融化后用無血清的培養液稀釋成50 mg/L，鋪于Transwell 小室的上室基底膜進行包被。各組MHCC97-H 細胞以胰酶消化，用無血清培養液饑餓處理12 h，將3×105個細胞接種到Transwell 小室的上室，下室緩慢加入600 μl 含15%胎牛血清的培養液，于常規培養箱繼續孵育48 h，取出小室，用棉簽擦去未穿過基底膜的細胞，以甲醇固定細胞，結晶紫染色，洗去染液，隨后在倒置顯微鏡下觀察穿膜細胞，分別計數各組穿膜細胞數。

1.2.6 劃痕實驗檢測MHCC97-H 細胞遷移能力 對數期的MHCC97-H 細胞接種到6 孔板中，于37℃培養箱繼續培養，待細胞單層鋪滿底部約90%時，用滅菌的槍頭進行劃痕，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，將劃落的細胞洗去，隨后按照1.2.3 方法分組和處理48 h，分別在處理0 h 和48 h 時在顯微鏡下拍照，計算各組MHCC97-H 細胞相對遷移率，相對遷移率（%）=（0 h 劃痕距離-48 h 劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100%。

1.2.7 ELISA 檢測上清液中MMP-2 和MMP-9 含量 MHCC97-H 細胞按1.2.3 法分組和處理48 h，分別收集各組細胞上清液，參照ELISA 檢測試劑盒使用說明書對MMP-2 和MMP-9 含量進行測定。

1.2.8 Western 印跡檢測MHCC97-H 細胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白水平 MHCC97-H 細胞按1.2.3方法分組和處理48 h，收集細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白進行定量測定，蛋白加熱變性，配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），取等量蛋白上樣，行電泳分離蛋白，隨后電轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在封閉液中孵育2 h，洗滌后加入稀釋的相應一抗，Wnt1、β-catenin 和Survivin 一抗均為1 ∶800 稀釋，4 ℃雜交過夜，洗滌后再加入1 ∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，洗滌后采用電化學發光（ECL）顯影，隨后獲取圖像，以β-actin 進行標定，分別計算各組MHCC97-H 細胞中目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0 軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 PLB 對MHCC97-H 細胞增殖抑制作用 不同濃度的PLB 對MHCC97-H 細胞增殖有不同程度的抑制作用，且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見表1。與24 h 和72 h 相比，PLB 在干預48 h 時對MHCC97-H 細胞增殖抑制作用的隨濃度的升高而快速增強，且未出現平臺期，后續選取干預48 h 作為實驗干預時間。計算獲得PLB 干預MHCC97-H 細胞48 h 的IC50 為8.25 μmol/L，選取約1/2 IC50 濃度4 μmol/L 作為后續實驗干預濃度。

表1 PLB 對MHCC97-H 細胞增殖抑制率的影響(,n=9,%)

表1 PLB 對MHCC97-H 細胞增殖抑制率的影響(,n=9,%)

與PLB 0 μmol/L 組比:1）P＜0.05；與同一時刻前一組比較:2）P＜0.05

2.2 PLB 對MHCC97-H 細胞克隆形成能力的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細胞克隆形成率明顯降低（P＜0.05），而LiCl 組克隆形成率升高（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組MHCC97-H細胞克隆形成率明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組MHCC97-H 細胞克隆形成率、相對遷移率、穿膜MHCC97-H 細胞數、MMP-2 及MMP-9 水平比較(,n=9)

表2 各組MHCC97-H 細胞克隆形成率、相對遷移率、穿膜MHCC97-H 細胞數、MMP-2 及MMP-9 水平比較(,n=9)

與Blank 組比較:1）P＜0.05；與PLB 組比較:2）P＜0.05

2.3 PLB 對MHCC97-H 細胞遷移能力的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細胞相對遷移率明顯降低（P＜0.05），而LiCl 組MHCC97-H 細胞相對遷移率升高（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl組MHCC97-H 細胞相對遷移率明顯升高（P＜0.05）。見表2。

2.4 PLB 對MHCC97-H 細胞侵襲能力的影響 與Blank 組比較，PLB 組穿膜MHCC97-H 細胞數明顯減少（P＜0.05），而LiCl 組穿膜MHCC97-H 細胞數增多（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組穿膜MHCC97-H 細胞數明顯增多（P＜0.05）。見表2。

2.5 PLB 對MHCC97-H 細胞上清中MMP-2 和MMP-9 水平的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細胞上清液中MMP-2 和MMP-9 水平明顯降低（P＜0.05），而LiCl 組中MMP-2 和MMP-9 水平升高（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組中MMP-2 和MMP-9 明顯升高（P＜0.05）。見表2。

2.6 PLB 對MHCC97-H 細胞中Wnt 信號活化的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達水平明顯下調（P＜0.05），而LiCl 組中Wnt1、β-catenin 和Survivin蛋白表達水平明顯上調（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達水平明顯上調（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 Western 印跡檢測MHCC97-H 細胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白的表達

表3 各組MHCC97-H 細胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達水平比較(,n=9)

表3 各組MHCC97-H 細胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達水平比較(,n=9)

與Blank 組比較:1）P＜0.05；與PLB 組比較:2）P＜0.05

3 討論

肝癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一〔9〕。目前肝癌的治療策略包括手術、化療和放療，由于化療藥物和電離輻射存在非特異性細胞毒性，在殺傷癌細胞的同時對正常細胞也產生毒害作用，因此導致其對患者的毒副作用較大；加之患者產生耐藥性和化療耐受性大大影響了肝癌的治療效果〔10〕。中藥用于臨床治療各種癌癥包括肝癌，可延緩并發癥的發生，提高患者的生活質量〔11〕。多項研究表明，PLB 對黑色素瘤、胃癌和食管癌等多種惡性腫瘤細胞有明顯的抑制作用〔12，13〕。研究顯示，PLB 處理通過抑制PI3K/Akt 途徑降低人舌鱗狀細胞癌CAL27細胞活力和集落形成，并增加細胞凋亡〔14〕。研究顯示，PLB 通過減少STAT3 的磷酸化抑制食管鱗狀細胞癌細胞的生長〔15〕。Kang 等〔16〕研究發現，PLB 通過抑制由FAK/AKT 途徑介導的Rho 相關激酶途徑降低了骨橋蛋白誘導的非小細胞肺癌A549 細胞的侵襲，抑制骨橋蛋白誘導的Balb/c 小鼠肺轉移。朱德強等〔17〕研究發現，PLB 能抑制索拉菲尼耐藥細胞HepG2R 增殖，促進細胞凋亡，通過提高HepG2R 細胞中活性氧（ROS）含量來改善對索拉菲尼的耐藥性。然而，PLB 對肝癌MHCC97-H 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及分子機制尚不清楚。

本研究提示PLB 在肝癌中發揮抗腫瘤的作用，這與以往研究〔18〕相符。MMP-2 和MMP-9 均通過降解細胞外基質成分賦予細胞轉移能力，在腫瘤侵襲和遷移中發揮重要作用〔19〕。本研究結果提示PLB可通過調控MMP-2 和MMP-9 的表達抑制MHCC97-H 細胞遷移和侵襲。Wnt 信號通路在正常胚胎發育和中樞神經系統中起關鍵作用，此外，它還調節細胞生長、遷移和分化等多種生物學行為〔20〕。研究表明，Wnt 信號通路在多種類型的癌癥中激活失調，因此，阻斷Wnt 信號傳導途徑是癌癥治療的策略〔21，22〕。β-catenin 在Wnt 信號傳導途徑中起關鍵作用，細胞質中β-catenin 通常通過蛋白酶體降解維持在較低水平。Wnt1 蛋白與卷曲蛋白受體的結合導致未磷酸化的β-catenin 積累，其轉移到細胞核中并激活Wnt 靶基因的表達，包括Survivin〔23，24〕。Survivin 是主要抗癌靶標之一，其屬于凋亡抑制因子，參與細胞分裂和凋亡抑制，可與β-catenin 相互作用調控腫瘤細胞的增殖〔25〕。本研究結果提示PLB 能抑制Wnt 信號通路的激活。此外，本研究結果表明PLB 可通過調控Wnt 信號通路抑制MHCC97-H 細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，PLB 可抑制肝癌MHCC97-H 細胞增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與阻斷Wnt 信號通路的激活有關。然而，在Wnt 信號通路中存在多個上游及下游靶基因，并且在肝癌靶向中存在復雜的調控網絡，因此有待后續實驗深入探究。