基于分子對接和網絡藥理學的黃芪-桑寄生-木瓜藥對治療骨關節炎的作用機制

涂澤松 羅漢文 譚志韻 岑景盛 （佛山市中醫院骨科,廣東 佛山 528000）

骨關節炎（OA）是一種以關節和骨骼結構呈進行性損傷為主要病理特征的慢性疾病，其中主要以關節軟骨受損最嚴重，如病情持續進展后期可逐漸出現關節僵硬、疼痛、畸形等癥狀〔1～3〕。此病好發于中老年患者，但也有研究證實青少年發病率也呈現上漲趨勢〔4，5〕。OA 的發病與年齡、肥胖、創傷、炎癥、過度運動、遺傳等多種因素關系密切，但其中復雜的發病機制仍無明確闡述〔6〕。目前OA 的治療方案主要以緩解疼痛、改善關節活動度為主要治療目標，多采用口服非甾體抗炎藥及關節腔內注射玻璃酸鈉等對癥治療為主〔7，8〕。雖然上述治療策略對OA 癥狀緩解療效明顯，但對延緩關節炎癥的發展進程作用有限，且長期服用常引起胃腸道損害、耐藥等較大不良反應〔9，10〕。因此，尋求高效低毒的治療藥物對OA 患者具有重要意義。

許多臨床文獻報道已證實中醫藥治療OA 的有效性〔11，12〕。其中中藥對是古今醫家在與疾病抗衡中運用中醫學理論辨證施方的“配伍”核心，雖組成簡單但在減毒增效方面又強于單味中藥〔13〕。黃芪、桑寄生及木瓜三藥常相互配伍為治療OA 的古今經典方劑所用，如麻黃溫痹湯、西藏雪蓮藥酒。《名醫別錄》中記載，桑寄生有“去痹”奇效，《日華子本草》原文表明桑寄生有“助筋骨，益血脈”諸功，而《本草綱目》也表明木瓜主治“轉筋及腰膝”。此外，中醫學認為OA 患者病程綿長難愈的特點與人體體質狀況及正氣休戚關系密切，如《素問遺篇.剌法》認為此病發生責之于正虛:“正氣存內，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”。故筆者認為OA 治療應以補益正氣為主，正虛得糾則血瘀絡阻自解，疾病漸愈。故臨床施方多配于有“補氣諸藥之最”之美稱的黃芪，《醫學衷中參西錄》中曰:“黃芪能補氣，兼能升氣，善治胸中大氣下陷”，三者配伍合用優勢互補，具補氣生血、舒筋活絡、強筋健骨之功，黃芪-桑寄生-木瓜藥對成分眾多，致使其中抗骨關節炎機制過于復雜，難以闡明。本研究擬通過此藥對為著眼點，結合藥對中所含化學成分、作用靶點和分子對接方面探究其分子機制，進而開展網絡藥理學分析，為黃芪-桑寄生-木瓜藥對治療OA 的藥效物質基礎與分子層面相關作用機制的充分明確給予科學依據。

1 材料及方法

1.1 材料 藥物中重要化合物數據源自中藥系統藥理學分析（簡稱為“TCMSP”）數據庫，源自數據庫GeneCards 與OMIM 的疾病相關靶點。PPI 網絡互作關系來源于STRING 數據庫。David6.8 數據庫進行共同靶點GO 富集和Kegg 代謝通路富集。

1.2 黃芪-桑寄生-木瓜藥對活性成分篩選 通過使用TCMSP 數據庫對黃芪-桑寄生-木瓜藥對重要活性成分及藥物作用潛在靶點進行篩選。以下為藥物篩選條件:口服利用度（OB）及類藥性（DL）分別為30%、0.18 及以上水平。部分化合物的DL 值雖然偏低，然而已有研究結果證實此類化合物切實具備一定活性，因此將其作為納入對象〔7〕。通過獲得的活性成分及其對應的潛在靶點進行成分-靶點作用關系網絡圖，篩選出藥對中作用最強的化合物。

1.3 疾病相關靶點的收集 借助數據庫GeneCards（https://www.genecards.org/）及OMIM 數據庫（http:// www.omim.org/）分別搜集OA 疾病相關靶點，取并集，表示可能為OA 潛在靶點。

1.4 藥物與疾病共同作用靶點 將1.3 中獲取的疾病相關靶點與1.2 中收集的藥對化合物潛在作用靶點通過Venny 系統平臺進行映射，取兩者交集，此可能為藥物與疾病共同作用靶點，將這些靶點向數據庫STRING 內導入，獲取蛋白靶點之間的互作關系網絡圖（PPI 圖），使用Cytoscape3.7.0 軟件將其相關信息進行網絡拓撲學分析，以2～3 倍中位數為篩選條件，篩選出關鍵作用靶點。借助MCODE 插件分析PPI，通過所得模塊，完成化合物靶點網絡圖的構建。

1.5 交集基因GO 富集及KEGG 通路富集研究 針對所得交集基因，借助數據庫David6.8 開展GO與KEGG 代謝通路這兩項富集分析，進一步剖析黃芪-桑寄生-木瓜藥對治療OA 潛在作用機制。

1.6 分子對接 使用ChemOffice 軟件將重要化合物的3D 結構進行構建，為了使能量最小化，以mol2格式存儲。借助PDB 獲取相互作用最密切的幾個靶點的3D 結構*PDB 格式，借用PyMOL 軟件對蛋白質進行去水、加氫等操作，利用Auto Dock Tools 軟件將化合物及靶點蛋白格式均轉換為*pdbqt 格式，最后通過運行Vina.exe 軟件進行對接。若結合能＜0，說明配體與受體之間可以自發結合，由于目前對于活性分子靶點的篩選尚無統一標準，本研究選取結合能≤-5.0 kJ/mol 的活性成分作為黃芪-桑寄生-木瓜藥對治療OA 靶點的篩選依據。

2 結果

2.1 黃芪-桑寄生-木瓜藥對重要化合物成分 在TCMSP 中數據中檢索找到化合物:黃芪87 個，桑寄生46 個，木瓜80 個。通過1.2 的嚴格篩選進一步剔除重復化合物的化合物，共獲得化合物23 個，見表1。進一步剔除無對應作用蛋白靶點的化合物，共有重要化合物19 個。

表1 黃芪-桑寄生-木瓜藥對化合物信息

2.2 黃芪-桑寄生-木瓜藥對重要化合物-作用靶點網絡圖分析 分析藥對內的19 個關鍵化合物及98個靶點基因后，借助Cytoscape3.7.1，完成這些化合物與相應靶點的網絡構建，同時開展拓撲學研究。在拓撲學分析方面，所借助的工具為軟件Cytoscape3.7.1 配備的分析工具Network Analyzer，經由網絡內各節點的度值（degree），對此節點的關鍵性展開評估，見圖1。經拓撲學分析能夠明確，該網絡圖中有120 個節點，470 條邊，以節點度由大到小排序，化合物中排名靠前的有:槲皮素（MOL000098）度值79，山奈酚（MOL000422）度值34，7-O-甲基異丁香酚（MOL000378 ）度值 19，異鼠李素（MOL000354）、（6aR，11ar）-9，10-二甲氧基-6a，11a-二氫-6h-苯并呋喃〔3，2-c〕鉻-3-醇（MOL000380）等重要化合物。作用靶點節點度靠前的有:NCOA2（12）、PTGS1（12）、PRSS1（10）。通過重要化合物與作用靶點之間的關系網絡圖可知，一個化合物可以作用于多個靶點，同時多個化合物也可以共同作用于一個靶點，說明黃芪-熟地-山茱萸藥對可能是通過多成分、多途徑、多靶點共同起效作用于疾病。

2.3 OA 疾病靶點及交集基因分析 GeneCards 數據中按照Relevance score≥4 檢索獲得OA 疾病靶點527 個，檢索OMIM 數據庫獲得29 個疾病有關靶點，對重復靶點匯總刪除處理后，最后所得強直性脊柱炎（AS）靶點為549 個。對于全部OA 靶點和藥物關鍵化合物靶點，借助在線分析軟件Draw Venn Diagrams 實施映射取交集處理，得到26 個共同作用靶點基因。

2.4 OA 疾病與黃芪-桑寄生-木瓜藥對化合物共同作用靶點交集蛋白基因分析 將共同作用基因導入STRING 數據庫及與Cytoscape3.7.0 相結合通過拓撲學分析得到，該網絡圖中聚類系數為0.735，節點為26，特征路徑長度為1.457，平均節點度為13.615，以靶點基因度值大于1.5 倍的平均節點度為篩選條件，篩選出白細胞介素（IL）-6（23）、胱天蛋白酶（CASP）3（22）、血管內皮生長因子（VEGF）A（22）、絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）8（21）靶點，說明這些基因靶點與OA 的發病與治療存在密切的聯系，蛋白互相作用見表2、圖2。

圖2 共同作用蛋白靶點互作網絡(作用越密切,連線越粗,相互作用越多,點越大)

表2 OA 疾病與黃芪-桑寄生-木瓜藥對共同作用靶點的度值和介數

2.5 OA 疾病與黃芪-桑寄生-木瓜藥對共同作用靶點的生物信息學分析 通過David 數據庫對映射出的26 個共同作用靶點GO 富集及KEGG 代謝通路富集分析，通過Bonferroni 校正，P＜0.05，GO 富集出生物過程（BP）39 個，主要為:凋亡過程的負調控、巨噬細胞衍生的泡沫細胞分化的負調控、對肌肉伸展的反應、對藥物的反應、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等生物過程。分子功能（MF）4 個，主要為:轉錄激活子（ATF）活性，RNA 聚合酶（pol）Ⅱ核心啟動子近端部位序列特異性結合、纖連蛋白結合、染色質結合、天冬氨酸型內肽酶活性。細胞成分（CC）5 個，主要為:細胞外空間、核、胞質溶膠、質膜的外側、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物。通過使用GraphPad Prism8.0.1 軟件將GO 富集可視化條形圖（圖3）。KEGG 代謝通路富集出62 條信號轉導通路。其中P值大小進行排序，發現17 條代謝通路與膝關節OA 關系最為密切，其中涉及腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、催乳素（PRL）信號通路、核因子（NF）-κB 信號通路、NLR 信號通路、TLR 信號通路、HIF 信號通路，使用OmicShare 數據庫將KEGG 通路內富集所得靶點數與P值，進行氣泡圖（如圖4）的繪制。通過此圖能夠發現，1 條KEGG 通路通常富集至若干個靶點基因，而1 個靶點基因又可同時見于若干條通路內。

圖3 作用靶點的GO 富集分析(橙色為生物過程BP；綠色為細胞組成CC；藍色為MF)

圖4 作用靶點的KEGG 通路分析的氣泡圖(前40 條)

2.6 黃芪-桑寄生-木瓜藥對中核心化合物及與OA重要靶點蛋白分子對接研究 現已明確，配體結合受體環節，能量愈弱，構象穩定性愈強，愈易于發生作用，此項研究中，將結合能≤-5.0 kJ/mol 作為其對接的篩選標準。結果顯示OA 疾病與黃芪-桑寄生-木瓜藥對中重要活性化合物與其共同作用的重要靶點分子對接親和力均遠遠＜-5.0 kJ/mol，因此，可以很好表明黃芪-桑寄生-木瓜藥對中重要活性化合物與OA 疾病的重要作用靶點有較好的結合活性，亦證明黃芪-桑寄生-木瓜藥對治療OA 具有良好的作用。分子對接結果見表3、圖5、圖6。

圖5 CASP3 靶點蛋白與重要化合物分子對接結果

圖6 IL6 靶點蛋白與重要化合物分子對接結果

表3 黃芪-桑寄生-木瓜藥對中核心化合物及與OA 重要靶點蛋白的結合能

3 討論

OA 是一種以關節軟骨進行性損傷合并關節周圍骨質增生為典型病理表現的慢性疾病〔14〕。目前多以老年群體常見，西醫治療方案多以對癥治療為主，而尚無遏制病源的方案〔15〕。中醫學認為OA 屬“骨痹”“痹病”范疇，屬本虛標實之證〔16，17〕，補益肝腎，舒筋活絡，精血充實，則筋骨得養，病漸痊。黃芪、桑寄生及木瓜三藥屬補益肝腎，強壯筋骨，舒筋活絡之品，且臨床配伍運用于中藥復方多具備價廉、低毒及劑型豐富等優點，值得推薦。

槲皮素是類黃酮家族的成員，在退行性疾病中具有抗氧化和抗炎特性。Feng 等〔18〕通過研究發現槲皮素可減輕氧化應激、內質網應激及相關細胞凋亡水平。此外，槲皮素通過激活sirtuin1/腺苷單磷酸激活的蛋白激酶（SIRT1/AMPK）信號通路來抑制內質網應激，側面印證了槲皮素可以保護SD 大鼠的OA 表現。Zhang 等〔19〕通過使用木瓜蛋白酶注射入關節腔來誘導OA 模型大鼠，結果表明，加入槲皮素治療的大鼠，TLR-4/NF-κB 信號傳導明顯受到抑制，而模型組大鼠的TLR-4/NF-κB 途徑受到刺激，說明槲皮素可以抑制這些OA 大鼠中炎癥因子（IL-1b 和TNF-α）的分泌，改善OA 癥狀（關節直徑和腳趾體積）。Noriyuki 等〔20〕觀察到槲皮素能有效改善中老年OA 患者Ⅱ型膠原的合成/降解平衡。Hiroaki 等〔21〕研究也證明槲皮素對改善老年OA 患者滑液特性有特殊作用。

眾所周知，山奈酚及其糖苷均具有藥理活性，包括有抗炎、抗癌、抗微生物、抗糖尿病、抗過敏、鎮痛、心臟保護和神經保護作用〔22～24〕。研究表明〔25，26〕，山奈酚在大鼠OA 中具有重要的抗炎和保護作用，其作用原理可能是通過IL-1β 刺激大鼠軟骨細胞中的NF-κB 途徑，可顯著降低在IL-1β 刺激的大鼠軟骨細胞中NO 和PGE2 水平及iNOS 和Cox-2 活動。異鼠李素是銀杏葉提取物之一，具有顯著抗炎、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節活性〔27〕，研究顯示〔28〕，異鼠李素可以顯著抑制iNOS 和PGE2 的產生及iNOS 和COX-2 的表達，從而使MIA 誘導的OA 大鼠體內的炎癥因子水平降低，軟骨細胞的丟失和軟骨結構的破壞都得到了明顯改善。在化合物-靶點網絡中，作用靶點節點度靠前的為:NCOA2（12）、PTGS1（12）、PRSS1（10），亦說明這些靶點可能是化合物作用最多的靶點。研究表 明〔29〕核受體 共激活因子（NCOA）2 在許多生理和病理過程（包括發育，內分泌調節和腫瘤發生）中起重要作用。研究表明〔30〕，通過抑制老年OA 患者中滑膜細胞PTGS1 的表達，可以抑制OA 滑膜細胞的遷移/侵襲能力，并促進OA 滑膜細胞的凋亡率，改善OA 癥狀。

本研究結果說明IL-6、CASP3、VEGFA、MAPK8基因靶點與OA 的發病與治療存在密切聯系。研究表明〔31〕，通過敲低OA 大鼠模型的IL-6 基因，可以導致基質金屬蛋白酶（MMP）-13 的表達和分泌受到抑制，可能與其抑制OA 軟骨細胞中c-FOS/AP-1 活性介導的炎癥刺激而發揮重要的抗炎作用有關。Cheng 等〔32〕研究提示miR-103a-3p 的上調可以顯著促進細胞增殖，抑制凋亡和炎癥，可能是與其抑制半胱氨酸（caspase）-3 的表達降低有關。研究表明〔33〕，中老年OA 患者的關節軟骨、滑膜和軟骨下骨中的VEGFA 上調，可以導致軟骨變性、滑膜炎和骨贅形成，通過降低小鼠原代軟骨細胞中VEGFA的表達，可以顯著抑制OA 的進展。以上均表明，通過干預這些靶點，可以從分子機制角度出發，有效改善老年OA 患者的臨床癥狀。該PPI 的分析中呈現出較其他基因聯系較為密切的靶點基因，亦是疾病發生發展最重要的基因。

本研究結果表明TNF 信號通路、HIF 信號通路、NF-κB 信號通路、TLR 信號通路、PRL 信號通路、NLR 信號通路均與炎癥反應、氧化應激、免疫調控等反應相關，研究表明〔34〕紅花素通過促進AMPK 磷酸化和SIRT1 表達來抑制TNF 誘導的NF-κB 活化和內質網應激，從而保護老年OA 患者的軟骨細胞并抑制炎癥，防止了OA 中的軟骨變性。研究證明〔35，36〕，炎性細胞因子、活性氧（ROS）和NO 也可能導致HIF-1α 的過度表達，臨床數據表明，中老年OA 患者中HIF-1α 表達上調，HIF-1α 水平升高與OA 的發展有關。Yang 等〔37〕研究證實了抑制HIF-1信號轉導通路，對老年OA 患者軟骨細胞具有保護作用，其作用機制可能是抑制IL-1β 誘導的老年OA患者軟骨細胞的炎癥反應，降低IL-1β 刺激的軟骨細胞中IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3 和MMP-13 的促炎細胞因子水平。NF-κB 途徑是涉及OA 發病機制的主要分解代謝途徑之一，在與OA 相關的炎癥介質的調節中起關鍵作用〔38，39〕，Chen 等〔40〕研究證明CA 顯著抑制LPS 誘導的人OA 軟骨細胞中NFκB 信號通路的活性，可以有效防治OA，其作用機制可能是通過抑制LPS 誘導的OA 軟骨細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-13 和ADAMTS-5 的表達。先天免疫系統是OA 炎癥周期的主要貢獻者〔41〕，有研究表明〔42〕，TOLL 樣受體（TLR）和NOD 型受體（NLR）信號轉導通路在調節OA 患者組織穩態方面也起至關重要的作用，在OA 中，TLR 具有啟動細胞防御和細胞死亡的雙重能力，Barreto 等〔43〕研究亦證明TLR激活可以導致存活信號和凋亡信號，這可能會對健康細胞和患病細胞產生不同的相對影響，并增加OA 細胞死亡的趨勢。

綜上，黃芪-桑寄生-木瓜藥對中的重要化合物與OA 重要作用靶點蛋白結合能非常接近，從分子角度亦可以說明其化合物可以很好與疾病的靶點蛋白結合，從而產生治療作用，且對多種生物學功能與多條信號轉導通路進行調節以達到治療的作用。側面也驗證了黃芪-桑寄生-木瓜藥對具備多化合物、多代謝渠道、多作用靶點的作用特征。