Hippo-YAP信號通路與心血管系統的研究進展

樊凌宇 綜述 趙輝 審校

天津市天津醫院心內二科，天津 300010

Yes相關蛋白(Yes-associated protein)即YAP，是一種多功能的細胞內連接蛋白和轉錄共激活因子，在Hippo信號通路中起中心樞紐作用。在哺乳動物中，Hippo-YAP通路的核心成分主要由三部分組成：(1)MST1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2)以及它的共因子SAV(Salvador)；(2)LATS1/2(large tumour suppressor homologue 1/2)以及它的調節蛋白Mob1；(3)YAP及其類似物TAZ(transcriptional Co-Activator with PDZ-binding motif)。MST1/2與SAV相互作用使LATS1/2蛋白磷酸化，LATS 1/2可以直接磷酸化YAP上的多個絲氨酸殘基，后者滯留在胞漿中被蛋白酶系統降解，從而限制了YAP/TAZ促增殖和抗凋亡的功能。當Hippo-YAP信號通路失活時，YAP/TAZ不能被磷酸化從而進入細胞核，通過與轉錄增強子激活域(TEAD)、SMAD和p73等轉錄蛋白結合，促進下游靶基因的表達，從而發揮YAP/TAZ的促增殖和抗凋亡活性。由此可見，YAP可以正向或負向調節大量基因表達，并根據細胞類型發揮不同的作用。

1 Hippo-YAP參與心臟發育

Hippo-YAP信號通路在控制器官大小方面發揮重要作用[1]，大量證據表明，YAP對心臟發育至關重要[2-8]。目前已經證明Hippo-YAP通路可以調節心肌、心外膜和心內膜的發育。在斑馬魚心臟的前體細胞中，當YAP/TAZ失活時細胞遷移能力受到損害，不能遷移到中線形成心管并導致心臟發育異常[9]。在哺乳動物中，平滑肌的YAP特異性缺失導致嚴重的心臟缺陷和血管發育異常[10]。YAP在胚胎小鼠心臟中的缺失使卵黃囊血管生成、絨毛膜尿囊融合和胚軸延長缺陷，阻礙心臟發育，從而導致心肌發育不良及死亡[11-12]。敲除了LATS2基因的小鼠胚胎由于中胚層過度增殖，心室發育不良而在胚胎期死亡[13]。在小鼠出生后，誘導心肌細胞YAP過度表達可以使心臟重量增加，但心肌細胞大小并未發生改變，而是心肌細胞的數量增多[14]。

離體心肌細胞的研究證實，YAP激活可以促進介導心肌細胞肥大的基因表達[14]。胎兒YAP過度表達促進心肌細胞增殖，特別是在小梁型心肌細胞中。然而，出生后的嬰兒細胞內YAP過度表達不會影響心肌細胞的生長或大小[15]。另一項研究表明Hippo通過與Wnt信號相互作用，起到限制胚胎內心肌細胞增殖和控制心臟大小的作用[16]。GUO等[17]發現Hippo-YAP通過影響連接心肌細胞的結構參與控制心臟發育。這些研究結果表明，Hippo信號通路的效應分子YAP在心臟發育過程，特別是心肌細胞的增殖調節中是必須的。

2 Hippo-YAP參與血管的新生和重塑

在血管生成過程中，部分內皮細胞通過解離黏附蛋白復合物(如VE-鈣黏著蛋白和黏著斑激酶)，使細胞間連接松動，從原始血管中逸出，增殖并與鄰近血管相連接[18-19]。最新研究顯示，磷酸肌醇3-激酶γ(phosphoinositide 3-kinaseγ，PI3Kγ)通過介導依賴YAP表達的環狀AMP反應元件結合蛋白(cyclic amp-response element binding protein，CREB)在新生內膜的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)表型調節中起重要作用[20]。PETER等[21]通過對敲除內皮細胞連接蛋白(junctional protein associated with CAD，JCAD)的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)研究發現，Matrigel基底膜上的內皮細胞自我網格形成能力下降，這是因為JCAD通過激活YAP使內皮細胞功能障礙，從而抑制血管的生成。WANG等[2]的一項研究表明，YAP在頸動脈狹窄過程中介導血管重塑，在頸動脈損傷后YAP表達明顯增加，而YAP缺失減弱了損傷所誘導的新內膜形成。血管新生參與了局部缺血導致的血管重塑，從而恢復了該部位的血液再灌注。Hippo-YAP通路對于調節內皮細胞的存活、增殖和遷移至關重要[22]。NAKAJIMA等[23]發現斑馬魚中的YAP突變使血管喪失穩定性。既往國內的一項研究報道，血管平滑肌損傷后YAP的快速上調有效地刺激了血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)的表達，該因子可誘導血管平滑肌細胞的表型轉換[24]。FU等[25]的研究同樣支持這一結果。此外，YAP的失活可以使內皮細胞管狀網格形成缺陷，這一作用是其通過降低血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)的表達抑制纖維蛋白凝膠中內皮細胞的發芽[26]。HU等[27]發現氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可通過微小RNA-496表達抑制Hippo-YAP/ZAP蛋白的正常表達，并誘導血管內皮細胞功能障礙。朱寧等[28]建立頸動脈結扎的大鼠血管重構模型，證明Hippo信號通路在頸動脈結扎大鼠的血管重構模型中明顯激活，同時發現其可能與細胞增殖、凋亡相關的Bax/Bcl-2比值發生改變，上述兩種變化可能共同參與平滑肌細胞增殖，促進血管重構。

血栓烷A2受體與血管損傷后的再狹窄有關，研究發現血栓烷A2特異性激動劑通過激活YAP/TAZ誘導VSMC遷移和增殖[29]。YAP作為轉錄共激活因子，可抑制過氧化氫誘導克隆5基因(Hic-5)和平滑肌肌球蛋白重鏈啟動子的活性，并誘導YAP下游可以控制細胞增殖的調控基因cyclin D1的表達，參與血管的重塑。在動物模型中，Hippo/YAP信號通路參與了血管再狹窄的發展。

過度的內質網(endoplasmic reticulum，ER)應激可誘導細胞死亡，TAKAGURI等[30]在雄性Sprague-Dawley大鼠的胸主動脈中分離出VSCM，并對培養后的VSCM用衣霉素進行處理。最終發現，內質網應激以時間依賴性的方式顯著增加了VSMC中Caspase-3和C/EBP同源蛋白的表達，使VSMC中的YAP磷酸化，從而下調YAP蛋白的表達，導致VSMC死亡。

3 Hippo-YAP調節心臟的再生

大量的研究表明YAP在誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)的產生中發揮了功能性作用[31-32]。直接證據證實，MST1消融可顯著增加iPSC的增殖和活力[33]。此外，敲除MST1還可提高成年皮膚成纖維細胞生成iPSC的效率，該機制涉及YAP的激活，這與YAP的增殖促進作用一致。維替泊芬是YAP的特異性抑制劑，可通過誘導YAP1的構象變化，抑制YAP1-TEAD復合物的轉錄活性[34-35]。HAN等[36]研究了YAP在中胚層細胞分化為心肌細胞中的調控作用，發現維替泊芬抑制的YAP的核易位導致人誘導多能干細胞(hiPSCs)的心肌細胞分化停滯，這表明YAP在心臟分化中發揮著不可或缺的作用。

MONROE等[37]建立了活性YAP(YAP5SA)高表達的小鼠模型，一周后有19%的心肌細胞(CM)進入S期(DNA復制期)，CM數量增加了40%，這表明YAP5SA的表達誘導成年小鼠心肌細胞進入增殖狀態，并具有胎兒樣染色質和轉錄活性，使心肌細胞增生和心臟肥大。microRNA(miRNA)是一組長度約為18～24個核苷酸的內源性非編碼RNA，通過對胚胎大鼠心室肌H9C2細胞的研究發現，在低氧環境下，H9C2細胞中miRNA-9上調而Yap1下調，而敲除miRNA-9則恢復缺氧誘導的H9C2細胞增殖，同時發現miRNA-9是通過與Yap1上3'UTR互補結合位點結合而發揮上述作用[38]。由于成年心臟心肌細胞再生能力有限，心肌細胞總數的逐漸減少最終引發心力衰竭[39]。YAP的激活和Hippo通路的失活都可以促進成人心肌損傷后心肌細胞的再生，保護心功能[40-43]。

4 Hippo-YAP調節心肌細胞凋亡和肥大

細胞凋亡和自噬參與心血管系統的正常發育和病理重塑。在心肌缺血/再灌注(I/R)損傷和心肌病中均觀察到心肌細胞凋亡[44-47]，最終導致心力衰竭。MST1是細胞凋亡的公認啟動子[48]，在調節心肌細胞的生長與死亡中起重要作用。敲除MST1和轉基因研究的結果表明，MST1促進心肌細胞凋亡，但抑制心肌細胞自噬[49-52]。MST1的NH2末端是其激酶結構域；而COOH末端是其二聚結構域，包括Salvador/RASSF/Hippo(SARAH)結構域。目前在MST1上發現五個磷酸化位點：MST1上的蘇氨酸183和酪氨酸433磷酸化導致MST1活化，而蘇氨酸120、387和絲氨酸438位點則導致MST1抑制。RASSF(Ras-association domain family，Ras相關結構域家族)蛋白在SARAH域結合MST1，使MST1二聚化，增強其功能活性[53]。雷帕霉素靶蛋白復合體2(mTORC2)在SARAH域中的絲氨酸438處使MST1磷酸化，從而降低活性。在心臟中，RASSF1亞型A(RASSF1A)與MST1相互作用并使其激活，從而促進心肌細胞凋亡并抑制成纖維細胞增殖。MST1被抑制后可促進心肌細胞自噬，從而防止心肌缺血后心臟重塑和功能障礙[54-56]。另一項研究表明，敲除MST1可以抑制心肌細胞壞死和心肌纖維化的發展[57]。MST1激活可抑制成纖維細胞增殖[58]，后者的增殖促進心肌缺血性損傷和心力衰竭的發展[59-60]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是心臟纖維化的促炎因子[58-59]。在成纖維細胞中，MST1激活會降低TNF-α表達，從而抑制心肌肥厚和纖維化[58]。免疫共沉淀研究表明，MST1是心肌細胞中肌鈣蛋白(cTn)I的調節劑[61]。具體而言，MST1在四個殘基(蘇氨酸31、51、129和143)處結合cTnI并使其磷酸化，磷酸化的cTnI結合能力下降，最終使心肌細胞收縮功能下降。最近的研究發現，脂多糖可以下調Yap表達[62]，而Yap過度表達可以維持心臟功能并減輕心肌細胞死亡[63]。

5 Hippo-YAP與心血管系統疾病

高血壓病時，血管內皮細胞的應力和生物力學拉伸增加，發生血管重塑。WANG等[64]將人臍動脈血管平滑肌細胞(HUASMC)接種在Matrigel涂層的硅樹脂中，并對細胞進行生物力學拉伸，觀察到通過生物力學拉伸可以下調YAP的磷酸化，誘導YAP/TAZ的活化和核定位，發揮促增殖和抗凋亡活性。

各種原因導致的心室后負荷增加(PO)可促進心臟肥大，以維持血壓和心輸出量，但最終導致心力衰竭，心肌細胞死亡增加。WW45(WW45cKO)是一種可以通過HIPPO信號通路上游激酶Mst1/2誘導LATS激活的支架蛋白，IKEDA等[65]敲除小鼠的WW45，并制作主動脈縮窄、增加心肌后負荷水平的動物模型，這些小鼠的心肌細胞核中顯示出較高YAP水平。與對照組相比，WW45cKO小鼠的LV功能障礙更為嚴重，表現為LVEF的降低和LV舒張末期容積的增大?；蚍治霭l現，這些小鼠促進心肌細胞分化的基因下調。

BYUN等[66]敲除小鼠特異性雜合YAP基因(YAP-CHKO)，同時制作心肌后負荷水平增加的模型，通過與對照組比較，YAP通過RAS同源基因家族成員A(RhoA)依賴的機制被激活，使心肌細胞適應性肥大，保護了心臟免受壓力超負荷誘導的功能障礙。WU等[67]的研究也支持上述研究結論。Akt信號被證明可調節心臟肥大，有研究證明心肌細胞中YAP和Akt之間存在聯系[68-70]，BYUN等[66]發現，在缺乏YAP的心臟中，對急性壓力超負荷的反應導致Akt激活，并提示YAP在這種情況下介導Akt信號傳導，調節心肌細胞的肥大。

肺動脈高壓的特征是血管收縮和肺血管異常重塑，這些改變使肺動脈壓力逐漸升高。包含膠原蛋白，蛋白聚糖，層黏連蛋白和纖連蛋白等分子的細胞外基質(ECM)在血管壁中變硬和增厚是血管重塑的主要過程。Dupont通過對人乳腺上皮細胞中YAP/TAZ轉錄活性的研究發現高硬度ECM通過對YAP下游靶基因的激活發揮作用，同時肺動脈外膜成纖維細胞在非軟質基質中培養后，YAP表達較高[22]。其發生機制目前認為是黏附到ECM的細胞在肌動蛋白和微管細胞骨架重組的參與下減弱LATS1/2的活性，進而激活YAP[71]。核細胞骨架還通過機械轉導參與YAP激活，這一過程通過Nesprin-SUN蛋白復合物直接與胞質的F-肌動蛋白相連[72-73]。整合素結合ECM和機械拉伸刺激，通過Src-PI3K-PDK1途徑增加YAP活性[74]。

在主動脈瘤中，VSMC凋亡直接導致主動脈壁結構的破壞[75]。YAP缺乏會增加體外靜態條件下VSMC的凋亡[76]。LI等[77]發現，在Stanford A型主動脈夾層患者的升主動脈壁VSCM中的YAP表達降低。在小鼠的動物模型中也觀察到類似現象。最新的研究發現Hippo-YAP信號通路也參與主動脈瓣鈣化的過程中[1]。

動脈粥樣硬化(AS)是一種動脈壁的慢性炎性疾病，是最常見的血管疾病之一[78-79]。越來越多的證據表明內皮細胞損傷引起的細胞凋亡在AS的發展和發病機制中起關鍵作用[80-81]。內皮細胞激活啟動血管炎癥進程，血液中單核細胞通過黏附到激活的內皮細胞，吞噬脂質后轉化為巨噬細胞，隨后可能發展為動脈粥樣硬化。YAP可以作為機械力傳導感受器將機械力信號傳導入內皮細胞使其激活，誘導動脈粥樣硬化形成。動物實驗證實，Hippo通路中活化的MST1促進巨噬細胞凋亡，同時抑制巨噬細胞自噬，可直接介導巨噬細胞凋亡導致動脈粥樣硬化[82]。Apo E-/-的小鼠行左頸總動脈部分結扎術導致嚴重的動脈粥樣硬化，研究發現小鼠有明顯的YAP/TAZ激活[83]。XU等[84]通過小鼠的動物模型發現，動脈粥樣硬化多發生于主動脈弓和動脈的分叉處，但在胸主動脈中發生較少，他們研究發現湍流導致YAP/TAZ激活，而層流通過LATS1/2降低YAP的磷酸化，同時減少了YAP的核定位和YAP靶基因如：富含同型半胱氨酸的蛋白61(Cyr61)、結締組織生長因子(CTGF)、生存素(Birc5)、錨蛋白重復域1(ANKRD1)等的表達，從而抑制YAP的活性發揮抗動脈粥樣硬化作用[84]。CHITRAGARI等[85]用免疫印跡分析法通過對HUVEC研究發現，暴露于穩定的層流中，磷酸化的YAP水平明顯降低。WANG等[83]的研究同樣支持上述觀點。PETER等[21]的研究證明JCAD對內皮細胞中的Hippo信號起負調控作用，JCAD通過與LATS2激酶相互作用激活YAP。最新的一項通過內皮細胞在體內和體外的研究發現，整合素α5β1及其下游激酶c-Abl的激活使血流剪切力(oscillatory shear stress，OSS)介導的YAP磷酸化，并核易位，使內皮細胞功能障礙從而促進動脈粥樣硬化的形成[86]。XIAO等[87]發現敲除VSCM中組織因子途徑抑制物-1(TFPI-1)(ApoE-/-)的小鼠，TFPI-1和血管動蛋白(AMOT)之間的相互作用明顯降低，通過這一作用使YAP的磷酸化水平降低，進而增加了細胞核中YAP的含量并導致其靶基因上調，促進平滑肌細胞的增殖和遷移，導致動脈粥樣硬化的發生和發展。XU等[88]對HUVECs的研究發現，血管樣蛋白4(vestigial-like 4，VGLL4)通過Hippo-YAP通路減輕了氧化低密度脂蛋白誘導的氧化應激、炎癥和功能障礙，并抑制了細胞凋亡，從而減慢動脈粥樣硬化的進程。

6 展望

Hippo-YAP信號通路是目前十分熱門的一個研究項目，不僅因其能夠調控細胞增殖、凋亡，更重要的是它和其他信號通路之間有著很大的聯系，能夠調節人體內很多反應。目前對Hippo-YAP通路的研究更多地局限在腫瘤細胞中，隨著研究的深入，不僅可以為人們了解心血管疾病的發病機制提供更多的理論基礎，而且可能為心血管疾病的預防和靶向治療帶來新的思路。