中性粒細胞胞外誘捕網作用于哮喘的研究進展

黃俊敏，趙紫嫣 綜述 王才春審校

海南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，海南 海口 571199

中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細胞衍生的細胞外支架，通常由組蛋白和顆粒蛋白裝飾的解聚染色質組成。最初被發現是研究中性粒細胞針對病原體的宿主防御機制。有許多的疾患與NETs的形成有關，例如在系統性紅斑狼瘡、囊性纖維化、敗血癥、糖尿病、動脈粥樣硬化和腫瘤等，已經報道了與NETs形成相關的病理機制。根據2020年全球哮喘倡議(GINA 2020)更新，數據表明哮喘影響全球約3億人[1]。哮喘的異質性反映了復雜的潛在分子機制，會導致疾病產生不同的表現。有研究表明，哮喘發展期間形成過量的NETs，其誘導了氣道上皮細胞的炎癥損傷[2]。目前就針對NETs的結構、對生物體的影響以及對于哮喘的作用和治療來進行闡述。

1 NETs的結構及形成

中性粒細胞是占比最大的白細胞類型。它們在骨髓中成熟，釋放到外周血液中，在那里循環6～8 h。然而，在組織中它們可以存活數天，通過內皮來滲出，它們通過血流進入組織，并沿著趨化梯度向感染部位遷移，是宿主針對病原體反應的重要組成部分。中性粒細胞被認為是免疫防御的第一線的一部分，可以通過吞噬、脫顆粒和產生NETs來對抗入侵的微生物[3]。中性粒細胞通過脫顆粒后產生殺菌分子來消除病原體。不同類型的顆粒按順序釋放，首先釋放三級顆粒(如組織蛋白酶、明膠酶)，然后釋放二級顆粒(如乳鐵蛋白、堿性磷酸酶、溶菌酶、腸溶菌素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和膠原酶)。最后分泌的初級顆粒含有最多的促炎和抗菌蛋白，如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、組織蛋白酶G、防御素[4]。

NETs是在2004年由BRINKMANN等[5]第一次提出。NETs具有復雜的三維結構。高分辨掃描電鏡分析顯示，NETs由直徑15～20 nm(染色質)的光滑纖維組成，其間點綴著＞25 nm的球狀結構域[3]。NETs的核心是含有帶負電荷的染色質作為主鏈的生物結構。這些結構裝飾有多達20種不同的抗菌蛋白和多肽，例如髓過氧化物酶(MPO)、組織蛋白酶G、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和組蛋白。中性粒細胞可被多種物質，如白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-α、脂多糖(LPS)、粒/巨噬細胞集落刺激因子、佛波醇-12-肉豆蔻-13-乙酸酯(PMA)等刺激[6]。NETs的形成常常會跟隨著中性粒細胞的破壞和病原微生物的死亡，這整一過程被定義成NETosis，會導致獨特形式的細胞死亡，這種死亡區別于凋亡或者壞死，從而使它們能夠截留和殺死微生物，從而保護宿主免受感染。相反，NETs的過度形成會激發相關自身免疫反應及炎癥反應等，導致各種疾病的發展。NETs的形成可總結為以下六個步驟：(1)中性粒細胞受到刺激后，細胞核特有的分葉結構喪失；(2)核膜和顆粒膜變得通透；(3)組蛋白失活導致染色質膨脹進入胞漿；(4)解聚的染色質與釋放的顆粒內容物聚集；(5)內膜丟失導致胞液細胞器消失；(6)質膜變得通透，內容物釋放到胞外空間[7]。

NETosis的形成有三種模式，第一種模式稱為自殺式，是最常見的一種類型。當中性粒細胞通過受體識別刺激后，通過蛋白激酶C激活絲裂原活化蛋白激酶-細胞外信號調節激酶(Raf-MEK-ERK)通路，進而使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活化，刺激活性氧(ROS)的產生，促使肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)催化組蛋白瓜氨酸化，從而使染色質發生解聚，另外活性氧通過誘導核膜逐漸分離和丟失，緊接著染色質經過膜孔釋放到細胞外來，從而促進NETs形成[8]。第二種模式稱為細胞核DNA釋放式，細胞膜和核膜的完整性得以保留，補體C3蛋白和Toll樣受體可促進此種形式產生[9]。第三種是線粒體DNA釋放式，這種形式依賴于ROS的產生，當中性粒細胞受到脂多糖或者粒/巨噬細胞集落刺激因子刺激后可產生[10]。

根據是否依賴于NADPH氧化酶，NETosis可分成兩種類型。第一種類型是NADPH氧化酶依賴性NETosis，依賴于線粒體ROS的產生。胞外信號調節激酶(ERK)信號導致NADPH氧化酶的激活和超氧自由基的產生，這些自由基被超氧化物歧化酶轉化成過氧化物[8]。MPO使得次氯酸轉化成為過氧化氫，進而激活NE。NE負責細胞骨架和核膜的降解，使細胞核內容物和細胞質混合在一起[11]。組蛋白被激活的PAD4去亞胺，MPO和NE對其進行蛋白水解，導致染色質解縮。染色質纖維與顆粒和細胞質蛋白結合，然后釋放到細胞外[12]。第二種類型是NADPH氧化酶非依賴性NETosis，一旦與鈣結合，胞漿中的PAD4就移位到細胞核中，作用于組蛋白上的帶正電荷的精氨酸脫亞胺為不帶電荷的瓜氨酸，從而促進染色質的解縮，特別是在啟動子區域[13]。

2 NETs的生物學作用

2.1 NETs對機體的積極作用各式各樣的細胞外和細胞內微生物誘導中性粒細胞可通過自殺式、非典型的NETosis觸發NETs。通過截留微生物，NETs阻止了微生物傳播到繼發感染部位，并且在某些情況下，NETs具有直接的抗菌功能。研究表明，NETs能限制生長或殺死菌體，如葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、宋內志賀氏菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、丙酸桿菌、銅綠假單胞菌等[8，14]，進而消除病原體。對于病毒方面，FUNCHAL等[15]發現，對于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，中性粒細胞是通過TLR7以及TLR8來辨別HIV-1衍生的RNA，從而釋放活性氧，隨后誘導NETs的形成。隨后可通過髓過氧化物酶和α-防御素的作用來對抗HIV。對于寄生蟲方面，ABDALLAH等[16]研究發現，在小鼠鼻內感染弓形蟲的模型中，中性粒細胞通過形成NETosis來誘捕并殺死機體中的病原體來阻止弓形蟲的傳播。

2.2 NETs對機體的消極作用中性粒細胞和NETs在生物機體內都會產生兩方面作用。它們都會保護宿主免受病原體的入侵，但是也會對機體產生破壞性，越來越多的證據表明，NETs的過度產生和這些結構的低效拆解可能會潛在地損害宿主，如自身免疫疾病和自身炎癥性疾病。已經由研究證明NETs對內皮細胞有毒性[17]。活化的內皮誘導了NETs的形成[18]，這會造成惡性循環，從而造成更大的損害，內膜發生病變進而會造成動脈粥樣硬化以及斑塊的形成。WARNATSCH等[19]發現，NETs在斑塊形成的過程中起著相當大的作用。當人類中性粒細胞與膽固醇晶體接觸時，它們會自發地發生NETosis。NAKAZAWA等[20]研究表明，顯微鏡下多血管炎患者血液中的IgG很容易誘導NETs，并且NETs的生成量與疾病的嚴重程度相關。類風濕性關節炎是一種主要發生在關節的慢性自身炎癥性疾病，滑液中有大量的中性粒細胞。由于大多數類風濕性關節炎自身抗體是針對瓜氨酸蛋白的，NETs及其瓜氨酸成分可能參與誘導自身反應性B細胞。與健康人體的中性粒細胞相比，類風濕性關節炎病患機體中的中性粒細胞，無論是從循環血液中分離出來的，還是從滑液中分離出來的，都觀察到了增多的NETs[21]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是慢性的中性粒細胞炎癥。長期暴露于吸入刺激物(如煙草煙霧)后，該類患者會頻頻發生細菌和病毒的感染，導致長期反復地發作甚至加重。已發現煙草煙霧直接誘導NETs形成[22]。COPD的嚴重程度也與NETs的數量有關，NETs的數量在加重期最高[23]。

3 NETs與哮喘

哮喘是一種異質性慢性氣道炎癥性疾病，其通常會出現反復喘息、呼吸急促、胸悶和/或咳嗽等。哮喘的主要發病機理包括各類型炎癥細胞浸潤、氣道高反應性、氧化應激[24]以及氣道重塑。此外，大多數哮喘患者表現出特征性的炎癥，即氧化應激，一種已知會導致生物損害的情況，指的是體內氧化應激和抗氧化防御機制之間的失衡。氧化應激使得大量中性粒細胞浸潤，各類酶形成以及分泌增多，形成相當大數量的氧化產物。在正常生理條件下，細胞內活性氧和活性氮水平維持在較低濃度。哮喘經常會伴隨ROS產生增加和抗氧化系統能力降低，導致氣道氧化應激[25]。研究表明，全球約有3億多人患有哮喘，其中有嚴重哮喘的人數就高達10%[26]，這使其成為最常見的慢性肺部疾病。在大多數患者中，小劑量吸入皮質類固醇療法能夠減輕氣道炎癥，并成功控制癥狀和惡化。其中5%～10%的哮喘患者受到嚴重哮喘的影響[27]。即使經過最大限度的治療，仍有相當比例的嚴重哮喘患者的癥狀處于次優控制狀態。這些持續失控哮喘患者的發病率很高，并且不成比例地使用哮喘醫療資源。在這個難以控制的哮喘人群中，表型的異質性和對現有治療方法的不同反應證明了潛在疾病相關生物學的復雜性和多變性。

哮喘根據臨床表現可分為激素依賴型哮喘、激素抵抗型哮喘、脆性哮喘以及致死型哮喘。根據觀察誘導痰中粒細胞的浸潤，哮喘可分為四種不同的表型，分別為嗜酸性粒細胞型、中性粒細胞型、混合性粒細胞型和少粒細胞型[28]。有研究發現約50%哮喘患者的氣道以中性粒細胞為主，且中性粒細胞與重癥哮喘、遲發型哮喘以及激素抵抗型哮喘的相關性大。2006年SIMPSON等[29]將誘導痰中的中性粒細胞含量大于61%的哮喘釋義成中性粒細胞型哮喘。控制哮喘的傳統治療方案側重于使用有效的抗炎藥，特別是類固醇，它們對效應細胞及其介體具有廣譜抑制活性。哮喘的緩解和控制藥物包括糖皮質激素、β2受體激動劑、茶堿、白三烯調節劑、抗IgE單克隆抗體、抗IL-5抗體和抗IL-4/IL-13抗體等[30]。中性粒細胞型哮喘患者通常病情較為嚴重，對傳統的糖皮質激素治療反應效果欠佳，甚至會加劇病情變化，因為糖皮質激素會延長中性粒細胞的生存期。

3.1 NETs在哮喘進展中的作用哮喘由于其病因復雜而難以治療，闡明其潛在機制對于開發低副作用的高效藥物非常重要。經過多年不斷的研究，發現NETs在哮喘的發生發展過程中產生出來的是消極的效應。氣道上皮位于宿主與外界環境的交界處，不僅是一道有效的物理屏障，而且也是抵御微生物、環境中刺激物和過敏原的第一道防線。氣道上皮通過其物理屏障功能、纖毛清除功能和天然免疫防御功能來維持呼吸道黏膜的健康[31]。它在哮喘的發病機制中起著核心作用。另一方面，其結構和功能的改變會直接影響到炎癥反應，促進疾病的形成。NETs的成分可損傷氣道上皮并引發炎癥反應。NETs可通過損傷血管內皮細胞、誘導血管內皮細胞產生IL-8和激活嗜酸性粒細胞釋放顆粒來促使機體發生炎癥反應[32]。此外，NETs的相關成分可能誘導黏液高分泌和氣道重塑，從而加重哮喘[33]。有研究發現，中性粒細胞型哮喘與其他類型的哮喘相比，誘導痰中的dsDNA以及NETs各類成分的水平顯著偏高[34]。有研究觀察到中性粒細胞型哮喘小鼠的支氣管肺泡灌洗液中的總細胞、巨噬細胞和中性粒細胞數量有顯著增加。對于細胞因子，哮喘小鼠的血清，支氣管肺泡灌洗液和肺組織中的腫瘤壞死因子-α、白介素-23、白介素-17、白介素-6和白介素-1β的水平均顯著升高[35]。WAN等[36]研究證明NETs通過TLR4/NF-κB途徑刺激氣道細胞表達趨化因子(CXCL1、CXCL2和CXCL8)，從而將中性粒細胞招募到病變部位。這些結果表明了NETs會增加哮喘的炎性細胞和細胞因子的數量。另外機體通過激活Raf-MEK-ERK通路，活化NADPH氧化酶，刺激ROS的產生，其通過誘導氣道上皮細胞的炎癥損傷從而促進哮喘的發病。一氧化氮也參與NETs的生成，機制之一可能是其活性氮參與氧化應激導致組蛋白瓜氨酸的形成[37]。

3.2 針對NETs的哮喘治療在哮喘發展過程中，過量的NETs和其相關成分的積累以及持續存在與哮喘嚴重程度、肺功能和癥狀惡化有關。因此迫切需要進一步探索有針對性的治療，調節NETs可能是哮喘的新靶標治療方法。CitH3、MPO和dsDNA被評估為NETs的生物標志物。有研究發現，給予DNase I通過減少肺泡腔和血漿中dsDNA-MPO復合體來分解NETs，并減輕了對仙臺病毒感染的早期炎癥反應。在感染急性期，抑制NETs形成的重要物質PAD4也能抑制白細胞的聚集和細胞因子的產生[38]。為了進一步證實NETs在仙臺病毒感染的早期炎癥反應中的作用，仙臺病毒感染的小鼠注射了PAD抑制劑氯脒，該抑制劑優先不可逆地使PAD4的鈣結合型失活。該研究表明氯脒可抑制中性粒細胞在肺泡腔的聚集和炎性細胞因子的釋放[38]。PHAM等[32]研究發現NETs可以通過損傷氣道上皮并觸發外周血中性粒細胞的炎癥反應導致哮喘加重。還有研究表明，通過減少巨噬細胞數量和抑制炎性細胞因子IL-1β的活性可以減少體內NETs的產生并改善中性粒細胞型哮喘小鼠的癥狀[35]。因此調節中性粒細胞形成的NETs可能是難治性哮喘的新治療方向。

核酸酶具有多種功能，例如獲取核苷酸的營養、允許或阻止外源DNA的攝取、控制生物膜的形成及擴散和調節宿主免疫反應[39]。TOUSSAINT等[40]發現鼻病毒感染小鼠模型會觸發dsDNA的釋放，并且與NETs的形成相關。進一步證明通過抑制NE或用DNA酶來降解NETs可以保護小鼠免受2型免疫反應的影響。LACHOWICZ-SCROGGINS等[41]發現了dsDNA高水平哮喘的新治療方法，例如用脫氧核糖核酸酶(DNase)吸入破壞NETs或針對炎癥小體的治療。致敏小劑量LPS誘導肺中性粒細胞上調CXCR4、CD49d和LAMP-1，從而釋放NETs。

一氧化氮是由L-精氨酸合成的一氧化氮合酶合成的一種氣體信號分子，有調節血管舒張、遷移、增殖、分化、凋亡等多種功能[42]。對40例哮喘患兒中性粒細胞的研究發現，加入去氫硝基鐵酰胺鈉(SNP)、PMA和LPS可產生一氧化氮。SNP可誘導NETs，并呈劑量和時間依賴性。PMA(160 nmol/L)誘導NETs的能力最強，LPS(200 ng/mL)次之，SNP(200μmol/L)最弱，哮喘組NETs數量明顯高于健康組。一氧化氮合酶抑制劑對PMA和LPS誘導的NETs具有相同的阻斷能力，而NG-硝基-L-精氨酸甲酯(500μmol/L)對SNP誘導的抑制作用最強，且呈時間依賴性[37]。

總之，還是需要更多的研究來不斷尋找用于減輕NETosis的療法。這可能需要使用聯合療法，如抗生素、抗病毒藥物和NETs靶向藥物，還需要評估對整體免疫系統的影響，從而以最大限度去減少對患者的不利影響。

4 小結

NETs與許多疾病的進展過程有關，雖然在清除病原體方面具有積極作用，但由于其中產生的酶、活性氧及其他導致組織損傷物質的釋放，因此也具有破壞性。哮喘的嚴重程度與生物體中的NETs水平呈正相關。所以抑制NETs的形成是防止NETs或其成分對哮喘有害作用的有吸引力的策略。希望將來可以通過加深對NETs形成背后的分子機制的理解，進一步闡明NETosis的調控以及研究其過程在哮喘中的作用及聯系。這將會是針對哮喘的一個新治療靶點。