案例式教學(xué)在《生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)》課程中的實踐與反思

周曉瑩 黃國輝 謝 瑩

（廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院 廣西·南寧 530021）

《生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)》是基于廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心構(gòu)建的基因組學(xué)研究平臺、蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺和細(xì)胞與免疫研究平臺等大型儀器設(shè)備為基礎(chǔ)，針對醫(yī)學(xué)門類下一年級學(xué)術(shù)型研究生開設(shè)的一門專業(yè)學(xué)位課，綜合了目前醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究相關(guān)的基礎(chǔ)實驗技術(shù)。本課程主要教授醫(yī)學(xué)實驗中涉及的最具代表性的實驗技術(shù)及應(yīng)用，了解實驗研究中的策略及技術(shù)應(yīng)用，涵蓋了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及細(xì)胞與免疫研究平臺的基礎(chǔ)技術(shù)，包括細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)染色、多聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、免疫印跡法（Western-blot）等等。課程宗旨是幫助科研入門的學(xué)術(shù)型研究生建立對常用實驗方法的基本原理、實驗儀器、實驗材料及操作流程的認(rèn)識。通過本課程的學(xué)習(xí)能使研究生對目前常用的生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)有一定的了解，對其基本原理及應(yīng)用領(lǐng)域有了加深認(rèn)識，為開展研究課題奠定基礎(chǔ)。

為了在有限的課時中實實在在地讓學(xué)生了解和掌握現(xiàn)代分子生物學(xué)基本理論和有關(guān)實驗的基本方法和技術(shù)原理，以提高學(xué)生的動手能力和創(chuàng)造性思維能力，本課程更注重研究生的實驗操作能力的培養(yǎng)，將3/5的課時安排（18學(xué)時）為實驗課。然而，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，學(xué)生對于課堂的知識僅僅止于實驗技術(shù)原理和實驗操作的掌握，但實際開展課題研究的時候則仍然會迷惘，不能很好的應(yīng)用課堂所學(xué)知識。單純的傳授每一個知識點(diǎn)，猶如每一片分散的拼圖。結(jié)合科研案例進(jìn)行教學(xué)，可以有效指導(dǎo)學(xué)生如何拼接各知識點(diǎn)。

1 《生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)》案例教學(xué)實例

本課程以教師發(fā)表的科研論文為案例載體，從課題設(shè)計思路到實驗方案設(shè)計，再到實驗技術(shù)原理講解，再到數(shù)據(jù)分析方法，系統(tǒng)性的幫助學(xué)生形成較完整的科研思維，真正理解和掌握在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中探索什么科學(xué)問題，需要使用什么實驗技術(shù)，且熟悉如何開展實驗。我們以廣西高發(fā)的特色腫瘤-鼻咽癌的科研論文 Inactivation of 3-hydroxybutyrate dehydrogenase type 2 promotes proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma by iron retention,Br J Cancer.2020 Jan;122(1):102-110為教學(xué)案例進(jìn)行闡述。

已知3-羥基丁酸脫氫酶2型（BDH2）是一種催化哺乳動物鐵載體生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的酶。基于前期的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) BDH2基因在鼻咽癌組織中轉(zhuǎn)錄失活，因此本案例論文主要目的探究BDH2在鼻咽癌中這個基因的異常表達(dá)及其可能的生物學(xué)功能。

1.1 體外細(xì)胞培養(yǎng)

研究的樣本除了來源于鼻咽癌組織和正常對照組織樣本，還可以是體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞系和正常鼻咽上皮細(xì)胞系。由此引入體外細(xì)胞培養(yǎng)的概念，即通過在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞得以生存、生長、繁殖，并能維持其主要結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)。

教授內(nèi)容：（1）掌握細(xì)胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)備使用方法和保養(yǎng)。（2）掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識：培養(yǎng)細(xì)胞的特性，培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件。（3）掌握實驗器材的清洗和消毒滅菌方法。（4）掌握細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑的要求和配制方法。（5）熟悉細(xì)胞培養(yǎng)常用合成培養(yǎng)液的特性。

討論交流：如何判斷細(xì)胞是否發(fā)生了污染？傳授學(xué)生相關(guān)經(jīng)驗，一旦發(fā)生細(xì)胞污染，應(yīng)當(dāng)如何處置，避免繼續(xù)大面積的污染。

應(yīng)用拓展：（1）原代細(xì)胞培養(yǎng)。（2）細(xì)胞功能實驗：細(xì)胞增殖實驗、克隆形成實驗、細(xì)胞遷移和侵襲實驗等。

1.2 實時熒光定量PCR

為證實 BDH2基因在鼻咽癌細(xì)胞系和組織中的異常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，需要使用PCR技術(shù)。PCR主要將五大要素混合，即：特異性引物、酶、dNTP、DNA模板和緩沖液（其中需要Mg2+），通過三個經(jīng)典的步驟：變性—退火—延伸，得以實現(xiàn)短時間內(nèi)在體外快速擴(kuò)增基因片段的目的。由于本研究研究對象是 RNA，因此需要使用反轉(zhuǎn)錄 PCR（RTPCR），即將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實時熒光定量PCR，是在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號達(dá)到定量的目的。

教授內(nèi)容：（1）掌握基因組DNA提取及純化的原理和方法，學(xué)會使用高速離心機(jī)和紫外分光光度計。（2）通過應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增目的基因，掌握PCR反應(yīng)的基本原理與技術(shù)。（3）掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。（4）掌握使用實時熒光定量 PCR方法檢測基因 mRNA表達(dá)的原理和方法，學(xué)會使用實時熒光定量PCR儀。

討論交流：實時熒光定量PCR的實驗方法有絕對定量法、相對定量法以及DDCT法，該如何進(jìn)行選擇？通過深入討論并凝練出三種方法的異同點(diǎn)，闡明其檢測原理，進(jìn)一步舉例說明什么情況下可以使用何種方法。

應(yīng)用拓展：（1）染色質(zhì)免疫共沉淀-PCR。（2）數(shù)字PCR技術(shù)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

為進(jìn)一步證實鼻咽癌中 BDH2分子在蛋白水平的表達(dá)改變，引入免疫組織化學(xué)染色技術(shù)。這是一種通過在抗體上結(jié)合可呈色的化學(xué)物質(zhì)，利用免疫學(xué)原理中抗原和抗體間專一性的結(jié)合反應(yīng)，檢測細(xì)胞或組織中是否有目標(biāo)抗原的存在。該方法不僅可以用來檢測 BDH2的蛋白表達(dá)量，也可以觀察BDH2所表達(dá)的定位。

教授內(nèi)容：（1）掌握免疫組化及免疫熒光標(biāo)記的原理和方法。（2）掌握免疫組化石蠟標(biāo)本的制備、石蠟切片的撈取及脫蠟、抗體標(biāo)記及顯色的方法。（3）學(xué)會病理圖像分析儀，以及染色結(jié)果的評分方法。

討論交流：導(dǎo)致免疫組化假陽性或者假陰性發(fā)生的相關(guān)因素和預(yù)防措施。強(qiáng)調(diào)實驗過程中陽性對照和陰性對照的必要性，對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷應(yīng)持科學(xué)的、慎重的態(tài)度。

應(yīng)用拓展：（1）免疫熒光染色法；雙重免疫熒光染色法。（2）細(xì)胞爬片-免疫染色法。

1.4 Western-blot技術(shù)

實驗已經(jīng)驗證 BDH2從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均在鼻咽癌組織中異常低表達(dá)，為了探究其對鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，研究人員構(gòu)建了BDH2的真核表達(dá)載體，通過外源性轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入鼻咽癌細(xì)胞中。為了驗證轉(zhuǎn)染是否成功，采用Western-blot方法驗證轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細(xì)胞中 BDH2蛋白的表達(dá)水平。該技術(shù)通過把電泳分離后的細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物 NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，其可以通過蛋白分子量大小來判斷其是否為特異性蛋白。

教授內(nèi)容：（1）掌握Western-Blot檢測的原理及應(yīng)用。（2）掌握細(xì)胞、組織等總蛋白質(zhì)提取及蛋白濃度的測定。（3）掌握Western-Blot檢測的實驗流程及關(guān)鍵條件的優(yōu)化。（4）學(xué)會SDS聚丙烯酰胺凝膠的制備、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印和化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒的使用。

討論交流：Western-blot和免疫組織化學(xué)染色法都可以檢測蛋白的表達(dá)量，兩者分別有什么優(yōu)勢和劣勢？通過對比加深印象，有助于學(xué)生對科研過程中對實驗手段選擇的判斷。

應(yīng)用拓展：（1）免疫共沉淀。（2）單細(xì)胞Western-blot技術(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是一種用于對懸浮于流體中的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)和分選。這種技術(shù)可以用來對流過光學(xué)或電子檢測器的一個個細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的多種參數(shù)分析，包括定量測定細(xì)胞DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞表面抗原等。對于腫瘤生物學(xué)方面的研究來說，流式細(xì)胞術(shù)最常用于檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期。

教授內(nèi)容：（1）掌握流式細(xì)胞儀的工作原理。（2）熟悉細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測的原理。（3）學(xué)會制備細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測的細(xì)胞樣本。（4）熟悉流式細(xì)胞儀的使用方法。

討論交流：如何選擇合適的熒光素？包括抗原密度、自發(fā)熒光、非特異性結(jié)合等等多方面考慮，從而培養(yǎng)學(xué)生從多個角度思考問題。

應(yīng)用拓展：（1）分選流式細(xì)胞術(shù)。（2）質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)。

2 案例教學(xué)反思

案例教學(xué)是一種開放式、互動式的教學(xué)方法，教學(xué)過程重參與、重感悟，是一種沉浸式的學(xué)習(xí)課堂，充滿了理性的思維。本課程事先安排學(xué)生通讀案例論文，為學(xué)生搭建一個模擬的科研場景，讓學(xué)生把自己納入研究過程中，仿佛作為研究人員全程參與了其中的主要實驗。通過討論、交流等互動方式，加強(qiáng)師生之間的交流，進(jìn)一步達(dá)到啟示理論和啟迪思維的目的，提高學(xué)生分析和解決問題的能力，更有獲得感[1]。

2.1 教學(xué)目標(biāo)

在《生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)》課程中，我們的教學(xué)目標(biāo)不僅包括知識目標(biāo)，還有能力目標(biāo)和情感目標(biāo)。知識目標(biāo)是學(xué)生可以掌握醫(yī)學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域中常用的實驗技術(shù)，掌握其原理及其應(yīng)用領(lǐng)域，熟練掌握實驗的操作。能力目標(biāo)包含學(xué)生獲取新知識的能力、批判性思維的能力、分析和解決問題的能力、交流和合作的能力、創(chuàng)新思維的能力。情感目標(biāo)主要有：（1）通過討論交流、聯(lián)合開展實驗等，體驗合作研究的快樂。（2）認(rèn)同腫瘤給家庭和社會帶來的影響，增強(qiáng)對患者的同情關(guān)愛之心和對社會的責(zé)任使命感。

2.2 教師角度

教師作為案例教學(xué)的主導(dǎo)者，其不再是單個知識點(diǎn)的教授方式，而是需要承上啟下，將課程內(nèi)容恰當(dāng)?shù)卮谝粋€研究型案例中。教師圍繞整體教學(xué)內(nèi)容，有針對性地選擇好案例。本課程選擇了任課老師參與發(fā)表的SCI論文，內(nèi)容為廣西常見高發(fā)腫瘤-鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制研究。一方面鼻咽癌為廣西醫(yī)科大學(xué)特色科研方向之一，增強(qiáng)學(xué)生對區(qū)域特色高發(fā)腫瘤的關(guān)注度和認(rèn)識度；一方面真正實現(xiàn)科研反哺教學(xué)，將科研運(yùn)用于教學(xué)有助于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力[2]。任課老師熟悉論文研究的過程，可以更好的作為案例討論過程的“引導(dǎo)者”，不斷推動學(xué)生的思維探究活動向縱深發(fā)展，以達(dá)成多維度的教學(xué)目標(biāo)。

2.3 學(xué)生角度

在案例教學(xué)中，學(xué)生是教學(xué)的主體，他們主動閱讀文獻(xiàn)、查閱資料、做實驗步驟設(shè)計、操作實驗并分析結(jié)果，整合加工有效的知識點(diǎn)。在討論交流過程中，傾聽他人觀點(diǎn)，并且陳述個人的見解，互相取長補(bǔ)短，從而對知識的理解也更系統(tǒng)和全面。學(xué)生在自主學(xué)習(xí)和體驗的過程中還收獲了不論是成功或是失敗的經(jīng)驗，體驗到科學(xué)探究的艱辛與樂趣，體驗到科研人員的辛勤付出，體驗到醫(yī)學(xué)科學(xué)進(jìn)步給人類健康帶來的巨大推動作用，激發(fā)起學(xué)術(shù)型研究生為醫(yī)學(xué)科研事業(yè)奉獻(xiàn)的熱情。