近紅外光譜法快速測定白芍中3種成分的含量*

劉高宏，魏立莉，劉惠玲

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰收汗之功，臨床常用于治療陰虛發(fā)熱、月經(jīng)不調(diào)、胸腹脅肋疼痛、四肢攣急、瀉痢腹痛、自汗盜汗、崩漏、帶下等癥［1］。沒食子酸、芍藥苷以及芍藥內(nèi)酯苷不僅是白芍中的主要活性成分，同時也是白芍發(fā)揮臨床療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，白芍的近紅外光譜定量模型多以芍藥苷為指標建立，檢測成分單一，難以全面反映白芍質(zhì)量的優(yōu)劣［2-4］。本研究以沒食子酸、芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷3種成分為指標，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法、偏最小二乘法等方法建立沒食子酸、芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷的定量校正模型，為大批量白芍飲片質(zhì)量優(yōu)劣的迅速、便捷和準確判別提供數(shù)據(jù)支撐［5-8］。

1 材料

1.1 儀器Antaris傅立葉變換近紅外光譜儀，配有積分球、樣品旋轉(zhuǎn)臺、樣品杯、光譜采集軟件和TQ8.3.125分析軟件（美國Thermo公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；梅特勒XS-105型電子分析天平（0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland）；梅特勒AL-204型電子分析天平（0.01 g，METTLER TOLEDO，Switzerland）；電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-500DB型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16B高速臺式離心機（江蘇聯(lián)創(chuàng)醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；MB45鹵素水分測定儀［奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司］。

1.2 試藥

1.2.1 對照品芍藥苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201337）；芍藥內(nèi)酯苷［鼎瑞化工（上海）有限公司，批號：39011-90-0］；沒食子酸（中國藥品生物制品檢定所，純度均≥98%，批號：110831-200803）；甲醇、乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2.2 樣品93批白芍生品均來自浙江磐安（甘肅隴中藥業(yè)有限責(zé)任公司），經(jīng)李喜香主任中藥師鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外光譜的采集將白芍生品粉碎過5號篩，每份樣品取約10g，混合均勻后放入石英樣品杯中，攤平，以內(nèi)置背景作為參比，扣除參比，采集光譜圖。采樣方式：積分球漫反射；波數(shù)區(qū)間：4000～10000 cm-1；分辨率8.0 cm-1；掃描次數(shù)64次；empty門衰減；增益為1；溫度（25±2）℃，相對濕度45%～50%。每份樣品掃描3次，求平均值作為樣品的NIR光譜，見圖1。

圖1 白芍生品的近紅外光譜

2.2 沒食子酸、芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷含量HPLC分析色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）柱，二極管陣列檢測器（DAD），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫，0～20 min，5%～10%A；20～35 min，10%～15%A；35～50 min，15%～18%A，流速1 mL/min，柱溫25℃，檢測波長255 nm；進樣量為10 μL。以峰面積定量，外標法計算沒食子酸、芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷含量。每批樣品平行進3針，求平均值，93批白芍中沒食子酸含量為0.0542%～0.2739%，芍藥苷含量為0.1936%～2.7648%，芍藥內(nèi)酯苷含量為0.0975%～0.8352%。

2.3 模型建立方法運用近紅外的漫反射原理，以偏最小二乘法（PLS）為建模算法。通過組合不同濾噪方法以及不同模型校正方法，比較不同方法組合條件下的相關(guān)系數(shù)（R）、預(yù)測均方差（RMSEP）、均方差（RMSEC）、性能指數(shù)（PI）和因子數(shù)（Factors）（見表1—3）。經(jīng)過多次手動選擇及綜合比較，最終選擇PLS+Second Derivative對光譜進行預(yù)處理所建立的白芍定量校正模型優(yōu)于其他組合，故選定采用該方法建立定量校正模型。見表1—3。

表1 沒食子酸定量校正模型的不同預(yù)處理方法比較

表2 芍藥苷定量校正模型的不同預(yù)處理方法比較

表3 芍藥內(nèi)酯苷定量校正模型的不同預(yù)處理方法比較

2.3.1 波段選擇以相關(guān)系數(shù)（R）和校正均方差（RMSEC）為指標，通過TQ Analyst軟件推薦，最終沒食子酸選擇8304.54～4974.39 cm-1波段建模，芍藥苷選擇4393.05～3999.64 cm-1波段建模，芍藥內(nèi)酯苷選擇4893.05～3099.64 cm-1波段建模。

2.3.2 因子數(shù)選擇建立模型時所選的主因子數(shù)對預(yù)測結(jié)果的影響相對比較大。如果PLS所用的因子數(shù)過少，光譜中一些有用的信息因不能被包含而導(dǎo)致模型的預(yù)測能力較差；反之，選擇的因子數(shù)過多，則出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象影響其結(jié)果。采用內(nèi)部驗證法，根據(jù)內(nèi)部交叉驗證均方差（RMSECV）隨主因子數(shù)的變化，沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷主因子數(shù)分別為10、7、5。

2.3.3 模型建立在所選擇的譜段范圍內(nèi)，由于本研究采用透射采集光譜，且光譜較為平滑，故直接用原始光譜建模。從白芍樣品中隨機選取83個為樣本集，7個為驗證集。經(jīng)Outliers優(yōu)化，剔出溢出值，以保證模型的準確性；運用PLS法建立沒食子酸的定量校正模型，建模因子數(shù)為10。結(jié)果見圖2，相關(guān)系數(shù)為0.99132，RMSEC為0.0055。驗證集的內(nèi)部驗證結(jié)果見表4，RMSEP為0.00896。從白芍樣品中隨機選取66個為樣本集，6個為驗證集；經(jīng)Outliers優(yōu)化，剔出溢出值，以保證模型的準確性；運用PLS法建立芍藥苷的定量校正模型，建模因子數(shù)為7。結(jié)果見圖3，相關(guān)系數(shù)為0.99869，RMSEC為0.0266。驗證集內(nèi)部驗證的結(jié)果見表5，RMSEP為0.10900。從白芍樣品中隨機選取76個為樣本集，6個為驗證集；經(jīng)Outliers優(yōu)化，剔出溢出值，以保證模型的準確性；運用PLS法建立芍藥內(nèi)酯苷的定量校正模型，建模因子數(shù)為5。結(jié)果見圖4，相關(guān)系數(shù)為0.97052，RMSEC為0.0349；驗證集內(nèi)部驗證的結(jié)果見表6，RMSEP為0.04210。

表4 沒食子酸內(nèi)部驗證結(jié)果 %

表5 芍藥苷內(nèi)部驗證結(jié)果 %

表6 芍藥內(nèi)酯苷內(nèi)部驗證結(jié)果 %

圖2 白芍中沒食子酸的PLS建模結(jié)果

圖3 白芍中芍藥苷的PLS建模結(jié)果

圖4 白芍芍藥內(nèi)酯苷的PLS建模結(jié)果

2.3.4 外部驗證用建立的最佳校正模型，對預(yù)測集中的沒食子酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量進行預(yù)測。白芍中沒食子酸的預(yù)測集結(jié)果見表7，近紅外測試的預(yù)測結(jié)果與真值之間建立回歸方程：y=0.9253x+0.2045，預(yù)測值與真實值的相關(guān)系數(shù)為0.9404。白芍中芍藥苷的預(yù)測集結(jié)果見表8，近紅外測試的預(yù)測結(jié)果與真值之間建立回歸方程：y=1.2257x-0.0918，預(yù)測值與真實值的相關(guān)系數(shù)為0.9412。白芍中芍藥內(nèi)酯苷的預(yù)測集結(jié)果見表9，近紅外測試的預(yù)測結(jié)果與真值之間建立回歸方程：y=1.0951x＋0.0055，預(yù)測值與真實值的相關(guān)系數(shù)達0.9446。

表7 沒食子酸外部驗證結(jié)果 %

表8 芍藥苷外部驗證結(jié)果 %

表9 芍藥內(nèi)酯苷外部驗證結(jié)果 %

3 結(jié)論

本研究將近紅外光譜法和化學(xué)計量法相結(jié)合，運用偏最小二乘法建立了快速檢測白芍中沒食子酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷含量的檢測方法，試驗證明該方法準確、便捷、污染小，可滿足大批量樣品的快速檢測要求，為控制白芍藥材及飲片的質(zhì)量提供了新手段［9-12］。

本研究所用白芍僅采自浙江，其他省份所產(chǎn)白芍在應(yīng)用本實驗所建立的的模型進行快速測定時，需要搜集一定數(shù)量樣品對模型進行必要的校正，以求得到更準確的結(jié)果。