八珍湯促宮頸成熟分子機制和生物通路的網絡藥理學研究

鄭丹如，盧海霞，許祿華，任利容△

1廣州中醫藥大學附屬深圳市寶安中醫院，廣東 深圳518101；2南京中醫藥大學附屬醫院

如何安全有效地終止妊娠，提高自然分娩率，降低剖宮產率，一直是產科關注的熱點課題。妊娠晚期由于妊娠期糖尿病、子癇前期、妊娠合并病毒性肺炎等并發癥，導致為保證母嬰安全而不得不適時終止妊娠［1］。目前，新型冠狀病毒感染孕產婦管理策略建議指出，對于妊娠合并病毒性肺炎的孕婦，若已足月，建議多學科診療，適時終止妊娠，如宮頸條件好，無陰道試產禁忌癥，可經陰道分娩。若宮頸不成熟，則需通過藥物或機械刺激促進宮頸成熟，誘發子宮收縮，以幫助產婦盡早經陰道分娩［2-4］。宮頸成熟的機制尚不明確，目前認為是多種因素綜合作用的結果，公認的學說有“炎癥反應學說”“內分泌控制理論”“機械性刺激”“子宮功能性改變”［5］。臨床主要通過靜脈滴注催產素、陰道用前列腺素類藥物、宮頸球囊擴張等機械性刺激或口服中藥來促進宮頸成熟。

《婦人大全良方》中提到“婦人以血為主，氣順則血和，胎安則順產”，氣血對婦女妊娠起重要作用。妊娠婦女易出現氣血不足，影響分娩。八珍湯具有氣血雙補，益胃健脾的功效，《傅青主女科》將八珍湯用于“催生”。傅氏認為：“催生者，因坐草太早，困倦難產，用八珍湯，稍佐以香附、乳香，以助血氣。胞衣早破，漿血己干，亦用八珍湯”［6］。近年來被用于促進宮頸成熟，并取得了良好的臨床療效［7-8］，且有利于產婦產后恢復。

2007年，“網絡藥理學（network pharmacology）”的概念由英國鄧迪大學藥理學家Hopkins在《自然生物技術》（Nature Biotechnology）雜志中首次系統闡述［9］，它基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡，運用專業的算法和可視化網絡分析軟件，對現有的疾病數據庫、藥物數據庫等數據庫信息進行虛擬篩選和網絡預測［10］，系統地評價藥物對疾病網絡的干預與影響，網絡藥理學具有整體性、系統性特點，與中醫藥“整體觀”和“辨證論治”原則一致，目前已被廣泛應用于中藥研究?；诰W絡藥理學方法，本研究將從“成分-靶點-通路”多層面預測八珍湯促進宮頸成熟的生物過程和生物通路，為其進一步藥理學研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 八珍湯藥物有效化學成分和對應靶點收集在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數據庫［11］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中以“人參、白術、茯苓、甘草、熟地黃、白芍、當歸、川芎”為檢索詞，并根據ADME參數設定篩選規則：OB≥30%，DL≥0.18，檢索得到八珍湯藥物有效化學成分和藥物靶點，進一步篩選獲得有效成分對應的靶點基因信息，最后通過Uniprot數據庫［12］（http：//www.uniprot.org/）對基因進行注釋，轉化為統一的Swiss-Prot ID（檢索時間：2020年2月1日）。見表1。

表1 八珍湯藥物部分化學成分基本信息

1.2 促宮頸成熟的相關靶點收集在人類基因數據庫（GeneCards[13]，https://www.genecards.org/）、孟德爾人類遺傳數據庫（online Mendelian inheritance in man，OMIM[14]，http://www.omim.org/）、DiGSeE[15]（http://210.107.182.61/geneSearch/）、Drug Bank 5.1.5[16]（http://www.drugbank.ca/更新于2020年1月3日）和治療靶標數據庫（Therapeutic target database，TTD［17］，http：//db.idrblab.net/ttd/）5個疾病相關基因庫中分別以“cervical maturing/ripening”為檢索詞檢索疾病相關基因靶點（檢索時間：2020年2月2日），匯總各大數據庫搜索得到的疾病相關基因靶點，剔除重復基因，導入Uniprot數據庫［12］（http：//www.uniprot.org/），統一將基因-蛋白名稱轉化為Swiss-Prot ID。

1.3 八珍湯促宮頸成熟的PPl網絡構建整理獲得疾病靶點基因與藥物成分靶點并進行映射，得到八珍湯促宮頸成熟潛在作用靶標，繪制Venn圖。將得到的藥物-疾病交集靶點導入STRING數據庫［18］（http：//string-db.org/，Version11.0），物種選擇設定為“Homo sapiens”，并進行置信度得分（confidence coefficient）篩選，以評估配體間匹配程度的可靠性，設定confidence coefficient≥0.900，標準區間為［0，1］，≥0.9為可靠性最高，0.7～0.9為可靠性高，≥0.4為可靠性中等，≤0.15為可靠性低。active interaction sources設定為Text mining、Experiments、Databases、Coexpression、Neighborhood、Gene Fusion、Cooccurrence，剔除游離點后導出網絡圖和數據。

1.4 “促宮頸成熟-基因-靶點-八珍湯有效成分”調控網絡構建和拓撲結構分析通過Cytoscape3.7.2軟件［19］的“Network Analyzer”功能［20］，對八珍湯促宮頸成熟進行中藥調控網絡的構建，并獲得相關參數，如平均最短路徑長度（average shortest path length）和接近中心性（betweenness centrality），節點的平均最短路徑長度越小，接近中心性越大，表明該節點在網絡中越重要［21］。導出網絡圖和數據，篩選出關鍵藥物有效成分和靶標。

1.5 GO和KEGG通路富集分析利用Cytoscape3.7.2中Clue GO插件，對關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析。將數據導入，分別選擇“Biological Process（生物過程）”“Cellular Component（細胞成分）”“Molecular Function（分子功能）”和“KEGG-Pathway（KEGG通路分析）”進行分析，得到相關數據，保存結果，并將所得結果按照qvalue排列，綜合“%Associated Genes”“Number Gene”等指標篩選可能與促宮頸成熟相關的排名靠前的生物過程和通路。

2 結果

2.1 八珍湯藥物有效化學成分和對應靶點設置OB≥30%，DL≥0.18，檢索和篩選后共獲得160個有效化學成分，其中人參22個，白術7個，茯苓15個，甘草92個，熟地黃2個、白芍13個，當歸2個，川芎7個，部分有效化學成分的基本信息見表1；檢索得到1690個有效成分對應靶點基因，其中人參193個，白術18個，茯苓18個，甘草1265個，熟地黃29個、白芍84個，當歸52個，川芎31個，匯總所有藥物靶點基因并剔除重復靶點基因，得214個基因。

2.2 促宮頸成熟相關靶點和“藥物-疾病”靶點交集以“cervical maturing”為檢索詞檢索5個數據庫，剔除重復基因靶點，共獲得4276個疾病基因靶點。將上一步得到的八珍湯藥物靶點和宮頸成熟的靶點進行映射，取兩者交集，可得八珍湯促宮頸成熟相關靶點基因，共175個，并繪制Venn圖，見圖1。

圖1 “疾病-藥物”韋恩圖

2.3 八珍湯促宮頸成熟的PPl網絡構建和分析175個有效成分靶標經STRING數據庫檢索和篩選得到702個蛋白-蛋白相互作用的靶蛋白，預測相互作用靶蛋白217個，網絡中各節點連接度的中位數為8.02，網絡p-value＜1.0e-16，平均局部聚類系數0.486。見圖2。

2.4 “促宮頸成熟-基因-靶點-八珍湯有效成分”網絡將有效成分靶標和靶蛋白數據導入Cytoscape3.7.2軟件，利用其網絡分析工具Network Analyzer進行網絡拓撲結構分析。連接節點數越多，圓點直徑越大，顏色越深；連接節點數越少，圓點直徑越小，顏色越淺。圓圈中心為促宮頸成熟，內圈為八珍湯八味藥物，中間為藥物有效成分，外圈為靶標基因。剔除最小圓點，獲得46個關鍵藥物有效成分和34個靶點，根據平均最短路徑長度（average shortest path length）和接近中心性（betweenness centrality），篩選出關鍵藥物化學成分16個和關鍵靶標14個。提示八珍湯中甘草、人參和白芍在促宮頸成熟中發揮的作用可能較其他藥物大；化學成分β-谷固醇（beta-sitosterol）、芒柄花黃素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、原阿片堿（fumarine）等及靶標前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2,PTGS2）、雌激素受體（estrogen receptor,ESR1）、雄激素受體（androgen receptor,AR）、腎上腺素能受體2（adrenrgic receptor 2,ADRB2）、核受體輔激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2,NCOA2）等在促宮頸成熟中發揮重要作用。見圖3、表2—3。

圖3 “促宮頸成熟-藥物-活性成分-基因”網絡模型

表2 16個關鍵化學成分的接近中心性和平均最短路徑長度

表3 14個關鍵靶標的接近中心性和平均最短路徑長度

2.5 八珍湯促宮頸成熟的GO富集分析Biological Process結果提示，共表達基因主要參與了對含氧化合物的反應、對脂質的反應、細胞對含氧化合物的反應、對有機循環化合物的反應、對激素的反應、積極調控多細胞生物過程、細胞群增殖的調節、積極調控細胞增殖等生物過程；Cellular Component結果提示，共表達基因主要涉及膜微結構、膜筏、突觸前膜固有成分、突觸前膜組成部分等細胞組分；Molecular Function結果提示，共表達基因具有激酶結合、蛋白激酶結合、DNA結合轉錄因子活性調節、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激酶活性正調控、蛋白激酶活性的正調控、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調控等分子功能。見表4。

表4 八珍湯促宮頸成熟GO富集分析

2.6八珍湯促宮頸成熟的KEGG通路富集分析通過Cytoscape 3.7.2中Clue GO插件對八珍湯促宮頸成熟的關鍵靶點進行KEGG通路的富集分析，篩選前10條通路（qvalue從小到大進行排序）。KEGG通路富集分析結果：八珍湯有效成分可作用于催乳素信號通路（prolactin signaling pathway）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、催產素信號通路（oxytocin signaling pathway）、松弛素信號通路（relaxin signaling pathway）等內分泌信號相關通路；白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）信 號 通路、MAPK signaling pathway（絲裂原活化蛋白激酶信號通路）等免疫炎癥相關信號通路；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信 號 通 路、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt信號通路）等多條信號通路。見表5。

表5 八珍湯促宮頸成熟關鍵靶標的通路富集分析

3 討論

通過網絡藥理學將八珍湯有效化學成分及其對應的靶標和基因，與促宮頸成熟的生物分子學信息進行網絡映射，獲得兩者關聯的靶基因175個；繼而應用STRING數據庫及Cytoscape軟件對八珍湯與促宮頸成熟之間的關系進行機制性計算和可視化分析，得到16個關鍵化學成分：β-谷固醇、芒柄花黃素、谷甾醇、山柰酚、原阿片堿等，14個 關 鍵 靶 標：PTGS2、ESR1、AR、ADRB2、NCOA2、PTGS1、NOS2、PPARG、ESR2、PGR、MAPK14、CCNA2、CHEK1、RXRA，最后進行GO和KEGG富集分析，獲得其作用的生物過程、細胞成分、分子功能和生物通路。

靶標PTGS2、MAPK主要通過IL-17、TNF、白細胞跨內皮轉移等炎癥免疫信號通路促宮頸成熟，ESR1、ESR2、NCOA2、NCS2、PGR、MAPK主要通過雌激素、孕激素、松弛素、催乳素等內分泌信號通路促宮頸成熟，RXRA通過PI3K-Akt、脂肪細胞因子等信號通路進行調節，MAPK則與上述通路中均產生作用，參與促宮頸成熟的調控。

“KEGG通路富集分析”結果顯示，八珍湯促宮頸成熟涉及雌激素、催乳素、催產素信號通路等激素信號通路和IL-17信號通路、白細胞跨內皮遷移、Toll樣受 體（Toll like receptor，TLR）、MAPK、T細胞等信號通路。宮頸成熟是多種因素作用的結果。雌激素、孕激素、催產素等體內與妊娠相關的激素信號通路的增強，導致雌激素、孕激素等激素水平上升，促進分娩啟動［22］。宮頸成熟類似于炎癥反應，由多種炎癥因子參與，通過白細胞跨內皮遷移和雌激素信號通路，雌激素誘導白細胞遷移進入組織，促進啟動體內非感染性炎癥反應，引起宮頸重塑和分娩［23］。MAPK信號通路是由雌激素和促炎化合物激活的質體受體介導，研究表明，MAPK激活對分娩前宮頸成熟起重要作用，它可以使子宮頸基質和平滑肌及c-Jun顯著增加，宮頸張力增強［24］。Toll樣受體信號通路被激活后啟動促炎因子如白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、TNF等的釋放，通過前列腺素（PGs）誘發子宮收縮和宮頸成熟。MMPs是一種水解蛋白酶大家族，可降解細胞外很多中基質蛋白，目前認為MMPs是宮頸成熟和分娩啟動的重要中間環節，炎癥因子的釋放激活MMPs系統使得宮頸細胞外基質蛋白水解而軟化和成熟［25］，MMPs主要通過IL-17、TNF、雌激素、松弛素等信號通路被激活。松弛素在生殖系統中發揮著重要作用，在妊娠足月時通過松弛素信號通路擴張外周血管，提高胎盤血供，松弛盆腔結締組織以利于分娩［26］。

八珍湯促宮頸成熟作用是多角度、多層次的，主要表現在靶標本身具有多維調控的特點，另一方面，靶標間交互錯雜，相互作用和影響。目前已發現的機制表明，宮頸成熟是多方面因素作用的結果，涉及非感染性炎癥反應、體內雌孕激素、催產素、泌乳素、松弛素等激素水平等。上述網絡富集結果表明，這些靶標在網絡中通過雌激素、催乳素、催產素、松弛素等內分泌激素生物通路和IL-17、白細胞跨內皮遷移、T細胞等炎癥發生相關生物通路和其他通路效應作用共同對宮頸成熟非感染性炎癥反應、激素水平和功能變化等多方面進行調控。

中醫學認為，氣血對妊娠起重要作用，氣血的充足有利于妊娠和分娩，宮頸的成熟是分娩啟動的重要一環。八珍湯為中醫名方，有著“補益氣血，益胃健脾”功效，《傅青主女科》用八珍湯“催生”，傅氏認為：“催生者，因坐草太早，困倦難產，用八珍湯，稍佐以香附、乳香，以助血氣。胞衣早破，漿血己干，亦用八珍湯”［6］。方中人參與熟地黃為君藥，人參甘溫，大補五臟元氣，補氣生血，熟地黃補血滋陰；臣以白術補氣健脾，當歸補血和血、潤腸通便；佐用茯苓健脾養心，白芍養血斂陰，川芎活血行氣，以使補而不滯；甘草益氣和中。這八味藥物，化學成分復雜，具有不同的組合形式，藥物間的組合可能產生新的作用，故利用網絡藥理學構建“促宮頸成熟-基因-靶點-八珍湯有效成分”網絡，揭示其可能在干預宮頸成熟相關生物分子和基因表達方面發揮整體調節作用，這與中醫“整體”觀念一致。孕期由于胎兒的消耗，孕婦貧血的發病率遠高于非孕婦［27-28］，基于以上提出對本方對應的“氣血兩虛”證型進行生物分子網絡研究和方證對應研究的假設，或可預測相關的臨床生物標志，使其有更大的臨床轉換價值。

另一方面，甘草與宮頸成熟的交集基因最多，關鍵化學成分主要為甘草、人參、當歸、白芍、川芎、熟地黃的化學成分，提示這幾味中藥可能在促宮頸成熟方面較其他藥物發揮更重要的作用。結合中醫方劑“君臣佐使”組方規則看，佐藥甘草有多個關鍵化學成分可通過多條生物通路促宮頸成熟，君藥人參和佐藥白芍、當歸亦有多個有效化學成分在促宮頸成熟中發揮重要作用。基于此提出對原方藥物用量比例的調整對促宮頸成熟療效影響的假設，進行科學合理的實驗驗證，則可利用發現的規律對促宮頸成熟的組方用藥用量進行進一步理性設計，使其有更大的臨床轉換價值。

本研究基于網絡藥理學對八珍湯促宮頸成熟的生物通路和效應機制進行預測和分析尚存在不足之處，如中藥藥物化學成分數據庫、促宮頸成熟的關鍵基因數據庫等有待進一步更新和完善，依賴中醫藥基礎與臨床研究數據的積累、計算與實驗方法等技術方法尚待完善，因此本研究結果尚不能全面、真實地揭示八珍湯復雜的效應機制。