苦參堿通過Pink1/Parkin途徑抑制線粒體途徑促進肝癌細胞凋亡的機制*

何 敏，岳鵬瑩，白寶平

延安大學西安創新學院，陜西 西安710100

肝癌是消化系統最常見的腫瘤之一，具有惡性程度高，手術效果差，預后差的特點［1-2］。我國肝癌發病率居世界前列［3］。據流行病學統計，我國每年肝癌的發病率為11%，并且有逐年增長趨勢［4］。目前針對肝癌的治療主要集中于放、化療及手術和介入治療［5-6］。

中藥具有毒副作用小，療效溫和的特點，對于身體狀況較差的晚期癌癥患者具有更佳的療效［7-8］。苦參堿是豆科植物苦參的主要成分，對慢性炎癥、心率失常及肝臟纖維化具有明顯療效，但是對于肝癌的治療效果不明確［9-11］。本研究探討苦參堿對肝癌的治療效果及對肝癌細胞系HepG2的增殖和凋亡作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥物Transwell試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；CCK-8檢測試劑盒（美國BD生物試劑有限公司）；AV-PI凋亡檢測試劑盒（美國BD生物試劑有限公司）；DMEM培養液（美國Gibco生物試劑公司）；胎牛血清（美國Gibco生物試劑公司）；兔抗人Pink1（美國Abcam生物有限公司）；Parkin抗體（美國Abcam生物有限公司）；Pink1、Parkin、Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9引物（上海生物化學有限公司設計并提供）；NSC 66389型3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，上海易匯生物科技有限公司)。苦參堿（北京伊塔生物科技有限公司，規格：20 mg；純度：HPLC≥98%）。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞系HepG2的培養人源性肝癌細胞系HepG2受贈于北京大學生命科學學院楊回清博士，培養基選擇DMEM培養基，加入15%胎牛血清和1%鏈霉素，置于5%CO2、37℃細胞培養箱，待細胞形態規則，傳代穩定后進行后續實驗。

1.2.2 細胞分組根據苦參堿的處理方法將肝癌細胞分成4組。對照組：將等量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）加入肝癌細胞，培養條件與另外兩組相同；0.5 g/L處理組：將0.5 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細胞，與肝癌細胞共同培養處理72 h；1.0 g/L處理組：將1.0 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細胞，與肝癌細胞共同培養處理72 h；抑制劑組：將Pink1/Parkin信號通路抑制劑3-MA 2 mL加入肝癌細胞，與肝癌細胞共同培養處理72 h。

1.2.3 免疫熒光法檢測Pink1，Parkin表達水平將上述4組細胞于24孔板處理72 h后，利用預熱的PBS溶液清洗3遍，每次5 min，加入25%甲醛溶液，固定細胞狀態。加入聚乙二醇辛基苯基醚-100（Triton-100），用于細胞破膜。加入5%胎牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），孵育30 min，PBS溶液清洗3遍后加入預先稀釋好的Pink1、Parkin兔抗人一抗，4℃避光過夜孵育。PBS清洗后加入山羊抗兔GFP標記的二抗，避光孵育30 min，PBS清洗后加入Hoechst染色，孵育10 min，PBS清洗后，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Real time PCR檢測Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax及Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達將上述4組細胞處理72 h后加入胰蛋白酶1 mL，混合均勻后提取細胞。采用Trizol法提取RNA，TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量檢測，根據反應體系的不同加入各試劑。采用L9700D型RT-PCR儀器[萊普特科學儀器（北京）有限公司]進行分析，總時間設置為2 h。基因引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Western Blot檢 測Pink1、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達將上述4組細胞處理72 h后，收集細胞，RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，95℃金屬浴煮沸后備用，同時按照Western Blot制膠說明配置分離膠和濃縮膠，查詢Pink1和Parkin分子量，根據分子量大小選擇配置10%分離膠和20%濃縮膠。加入20 μL上樣蛋白，直流電電泳100 min，交流電電泳10 min。待蛋白電泳分離，等離子轉膜后加入Pink1、Caspase-3和Caspase-9兔抗人一抗（Abcom公司，1∶1000稀釋），4℃避光孵育過夜（＞12 h）。12 h后PBST洗膜，每次20 min，加入山羊抗兔IgG二抗（艾美捷科技有限公司，1∶5000稀釋），避光孵育1.5 h，PBST洗膜，每次20 min，重復3次，DAB顯影液處理。Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.6 Transwell小室實驗檢測細胞遷移按照Transwell 6孔板試劑盒說明書要求，配置基質膠，鋪在Transwell侵襲上室，4組細胞處理72 h后收集細胞，Transwell侵襲上室，孵育30 min，下室加入DMEM培養基，含15%FBS，1%鏈霉素，37℃的孵育箱孵育24 h，加入結晶紫染色試劑，孵育15 min后用倒置光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 細胞增殖檢測4組細胞處理72 h后收集細胞。按照CCK-8試劑盒說明書加入10 μL CCK-8溶液。酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.8 細胞凋亡檢測4組細胞處理72 h后收集細胞。按照AV-PI試劑盒說明書檢測4組細胞凋亡率。流式細胞儀檢測上樣4組細胞量，分析4組細胞早期和晚期凋亡率。

1.3 統計學方法應用SPSS 18.0分析數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，各組間比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測結果Pink1、Parkin蛋白表達量對照組較多，0.5和1.0 g/L苦參堿處理組較少，抑制劑組多于0.5和1.0 g/L苦參堿處理組。見圖1—2。

圖1 各組Pink1表達

2.2 細胞的PCR檢測結果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA的含量低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于0.5 g/L苦參堿處理組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于抑制劑組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組Pink1 mRNA含量與抑制劑組比較差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3A）。Parkin和Bcl-2的mRNA表達特點與Pink1相同（圖3B-C）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于0.5 g/L處理組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于抑制劑組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組Bad mRNA含量與抑制劑組比較差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3D）；Bax、Caspase-6、Caspase-9和Caspase-3的mRNA表達特點與Bad相同（圖3E-H）。

圖3 各組Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax、Caspase-6、Caspase-9及Caspase-3的mRNA表達

2.3 細胞的Western Blot檢測結果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于0.5 g/L苦參堿處理組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于抑制劑組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組Pink1蛋白含量與抑制劑組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；Parkin蛋白表達特點與Pink1相同。見圖4。

圖4 各組細胞的Western Blot檢測結果

2.4 細胞增殖能力檢測0.5和1.0 g/L處理組細胞的增殖能力低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細胞增殖能力低于0.5 g/L處理組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細胞的增殖能力低于抑制劑組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組細胞的增殖能力與抑制劑組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞的增殖能力

2.5 細胞侵襲能力檢測0.5和1.0 g/L處理組細胞的侵襲能力低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細胞的侵襲能力低于0.5 g/L處理組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細胞的侵襲能力低于抑制劑組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組細胞的侵襲能力與抑制劑組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞的侵襲能力

2.6 細胞總凋亡率檢測0.5和1.0 g/L處理組細胞的總凋亡率高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細胞的總凋亡率高于0.5 g/L處理組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細胞的總凋亡率高于抑制劑組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組細胞的總凋亡率與抑制劑組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組細胞的凋亡率

圖2 各組Parkin表達

3 討論

肝癌的惡性增殖與易復發特性是臨床比較棘手的問題，所以如何控制肝癌的增殖問題是治療肝癌的難點問題［12］。既往治療方法主要集中于手術切除，動脈介入栓塞和放化療相結合，但是也存在術后效果差，復發率高，生存期短的問題［13-15］。隨著祖國醫學的繁榮，越來越多的學者將研究焦點集中于中醫藥對腫瘤的治療效果方面［16］，本研究觀察苦參堿對肝癌細胞的增殖和凋亡以及遷移作用，此為本研究的創新點。

3.1 苦參堿對肝癌細胞增殖的抑制作用既往研究證明，苦參堿可以參與炎癥調節、心肌細胞的自噬以及肝臟的纖維化［17］，對于腫瘤的療效方面報道較少。本研究利用CCK-8試劑盒檢測苦參堿對肝癌細胞增殖能力的影響，結果表明，苦參堿可以抑制肝癌細胞增殖。利用Transwell試劑盒檢測苦參堿對肝癌細胞遷移能力的影響，結果表明，苦參堿可以抑制肝癌細胞遷移。利用AV-PI凋亡試劑盒檢測苦參堿對肝癌細胞凋亡的影響，結果表明苦參堿可以促進肝癌細胞凋亡。

3.2 苦參堿可能通過Pink1/Parkin信號通路促進肝癌細胞凋亡線粒體功能失衡與細胞凋亡密切相關，其中線粒體內膜和外膜電位的翻轉和線粒體功能的紊亂是細胞內線粒體功能失衡的標志之一［18］。多種信號通路參與線粒體功能失衡，Pink1/Parkin信號通路是其中比較經典的通路之一，既往研究表明，Pink1/Parkin信號通路參與帕金森神經系統退變過程［19］。另外也有學者證明，Pink1/Parkin信號通路可以通過激活線粒體融合蛋白2的過度表達進一步調節心肌細胞的再灌注損傷過程［20］。本研究以Pink1/Parkin信號通路為切入點，利用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot檢測Pink1和Parkin的表達，從基因和蛋白層面證明了苦參堿可以抑制Pink1和Parkin表達。結合AV-PI檢測結果，我們推論苦參堿可能通過抑制Pink1/Parkin信號通路表達促進肝癌細胞凋亡。

B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）是與細胞凋亡密切相關的蛋白分子，其作用機制是促進線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，抑制原癌前體蛋白激活，抑制細胞凋亡［21］。Bad和Bax蛋白是Bcl-2的下游蛋白，Bcl-2的激活通過AKT通路，抑制Bad和Bax蛋白表達，從而抑制細胞凋亡。反之，Bcl-2的抑制會促進Bad和Bax蛋白表達，促進細胞凋亡［22］。本研究以Bcl-2，Bad和Bax為切入點，利用RT-PCR方法從基因層面探究苦參堿對肝癌細胞的凋亡作用。結果表明，苦參堿可以抑制Bcl-2表達，促進Bad和Bax表達，達到促進肝癌細胞凋亡的目的。

3.3 苦參堿對肝癌細胞的促凋亡作用具有劑量依賴性本研究結果表明，相較于0.5 g/L苦參堿組，1.0 g/L苦參堿組可以明顯抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡；抑制Pink1/Parkin蛋白及Bcl-2的表達，促進Bax和Bad表達。表明苦參堿對肝癌細胞的促凋亡作用具有劑量依賴性。

總之，苦參堿可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力，促進肝癌細胞凋亡，并且具有劑量依賴性。