景衣安神散穴位貼敷對失眠大鼠行為學及相關細胞因子的影響*

胡金霞，楊 帆，盧 軍，王洪霞，江 鈺，劉 濤，胡曉靈△

1新疆維吾爾自治區中醫藥研究院，新疆 烏魯木齊830000；2新疆軍區總醫院健康管理科

失眠為臨床常見病，多發病。隨著社會發展，本病發病率逐年升高。有報道2006年中國內地成年人中有失眠癥狀者達57%［1］。失眠嚴重危害人類身體健康，是高血壓、心肌梗死、慢性心力衰竭、2型糖尿病的重要危險因素之一［2-6］，并且和癡呆呈正相關［7］。導致失眠的病因復雜，與心理、社會和環境因素密切相關，病機涉及神經、內分泌及免疫等方面。失眠是與神經免疫系統失衡的相關疾病。參與神經-內分泌-免疫網絡調節的細胞因子主要有白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）［8］。IL-1β具有多種生物學功能，通過調節控制睡眠作用來參與睡眠-覺醒過程。TNF-α在免疫系統影響睡眠過程中起中介作用。基于此，本研究采用景衣安神散穴位敷貼于對苯丙氨酸（PCPA）致失眠模型大鼠的神闕、內關穴，通過觀察失眠大鼠行為學以及炎性細胞因子，探討其治療失眠的機理。

1 材料與方法

1.1 動物分組根據我國科技部發財字（2006）398號《關于善待實驗動物的指導性意見》中有關內容處置動物。雄性大鼠64只，由新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心提供，動物許可證號：SCXK新2003-0002，體質量（200±20）g。飼養室溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，光照充分，定時通風換氣，飼養期間大鼠自由攝水及飲食。飼養7天后隨機分為對照組、模型組、空白組、實驗組各16只。其中模型組、空白組及實驗組腹腔注射PCPA制造睡眠剝奪模型［9］。

1.2 PCPA致失眠大鼠模型的構建

1.2.1 失眠模型的建立將PCPA（艾覽化工科技有限公司，貨號A46786）用弱堿性生理鹽水配置成混懸液，按45 mg/100 g體質量腹腔注射，每天1次，連續注射2天造模。

1.2.2 造模成功的評判標準與對照組比較，造模后大鼠行為發生改變，如晝夜節律顛倒，白天活動明顯增多，睡眠時間減少，性情煩躁，攻擊性增強，表明造模成功［10］。

1.3 方法

1.3.1 對照組與模型組對照組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液（國藥集團新疆制藥有限公司，國藥準字20023486，100 mL∶0.9，規格：1 mL/100 g）每日1次，連續注射2天，飼養7天。模型組僅造模不進行任何干預，飼養7天。

1.3.2空白組敷貼方法參考文獻［11-13］：固定大鼠后將神闕、內關穴穴位附近的毛剪短，脫凈，大約1 cm×2 cm大小，75%酒精消毒，將空白敷膜敷貼于穴位上，每天1次，每次30 min，連續7天。

1.3.3 實驗組造模后將景衣安神散敷貼于神闕、內關穴，貼敷方法同空白組。

1.4 觀察指標

1.4.1 行為學于第7天觀察各組大鼠行為。

1.4.1.1 曠場實驗將大鼠放入40 cm×40 cm敞箱（箱壁和底為黑色，箱底用黃色膠帶劃分為面積相等的16個矩形）的中央，大鼠在木箱中適應1 min，在安靜環境中記錄3 min內橫跨格子數（四爪均進入方格可記數）及站立次數（兩前爪騰空或攀附箱壁可記數，洗臉不算）、中央格停留時間、修飾次數以及糞便數。實驗結束后取出大鼠［14］。

1.4.1.2 懸尾實驗大鼠被懸掛于距離桌面50 cm高的水平環狀架桿上，用膠帶固定鼠爪尖2 cm，記錄1 min內大鼠倒掛時向上翻轉掙扎的總次數，并用秒表記錄大鼠靜止不動狀態的總時間（絕望時間）［10］。

1.4.2 細胞因子測定實驗第8天用100 g/L水合氯醛大鼠腹腔注射（2～3 mL/kg）麻醉大鼠后，腹腔靜脈取血3 mL，靜置1 h后，4℃過夜，離心半徑13.5 cm，1500 r/min，離心30 min，取上清液，采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immuno sor‐bent assay,ELISA法）檢測IL-1β［ELISA試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP12225）]以及TNF-α［ELISA試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP12250）]。

1.5 統計學方法采用SPSS 23.0統計軟件分析數據,以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 失眠大鼠行為學

2.1.1 大鼠空曠實驗評分與對照組比較，模型組大鼠空曠實驗得分增加、中央格停留時間縮短，修飾次數和糞便顆粒增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組大鼠空曠實驗得分降低，中央格停留時間縮短，修飾次數與糞便顆粒數減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；與空白組比較，實驗組大鼠空曠實驗得分減少，中央格停留時間縮短，糞便顆粒數減少，差異有統計學意義（P＜0.05），修飾次數差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠空曠實驗結果（±s）

表1 各組大鼠空曠實驗結果（±s）

注：△表示與對照組比較，P＜0.01；*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與空白組比較，P＜0.01

?

2.1.2 懸尾實驗與對照組比較，模型組大鼠掙扎次數增加、絕望時間延長差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，實驗組大鼠掙扎次數與絕望時間縮短差異有統計學意義（P＜0.01）；與空白組比較，實驗組大鼠掙扎次數增加，絕望時間延長，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠掙扎次數與絕望時間比較（±s）

表2 各組大鼠掙扎次數與絕望時間比較（±s）

注：△表示與對照組比較，P＜0.01；*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與空白組比較，P＜0.01

?

2.2 血清lL-1β與TNF-α含量與對照組比較，模型組大鼠IL-1β與TNF-α含量降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，實驗組大鼠IL-1β與TNF-α含量增加，差異有統計學意義（P＜0.01），空白組大鼠IL-1β含量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白組比較，實驗組IL-1β含量增加，差異有統計學意義（P＜0.01），TNF-α含量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清lL-1β與TNF-α含量（±s）ng/mL

表3 各組大鼠血清lL-1β與TNF-α含量（±s）ng/mL

注：△表示與對照組比較，P＜0.01；*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與空白組比較，P＜0.01

?

3 討論

失眠，又稱睡眠障礙，睡眠質量下降，不能正常入睡，睡眠時間變短，睡眠輕淺，容易覺醒，甚至徹夜不眠，使患者身心健康受到嚴重影響［15］。近年來，發病率逐漸升高，據報道，我國成年人中失眠發生率達38.2%［16］。失眠常伴有焦慮、抑郁等不穩心態，不但影響患者的日常生活，同時可以誘發或加重軀體其他疾病，嚴重影響患者生活質量。現代醫學認為，失眠的發生有社會-心理-環境的諸多因素，主要與下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸調節失衡有關，神經免疫調節網絡是機體調整內穩態的重要物質基礎。當細菌、病毒侵犯機體后激活免疫系統，通過中樞神經系統影響HPA軸，參與睡眠調節。IL-1β與TNF-α均為參與HPA軸調節睡眠的細胞因子［10］，通常作用于下丘腦視上核神經元，刺激神經內分泌激素分泌，從而調節睡眠。在生理狀態下IL-1β可以調節神經系統、內分泌功能以及免疫系統，參與免疫應答，促進睡眠。研究證實IL-1β在睡眠開始時達到峰值[17]，明顯促進慢波睡眠，參與睡眠調節。人剝脫睡眠后，腦脊液與體液中IL-6的含量增加，外周IL-1含量減少［18］。SINT等［19］發現失眠時IL-1含量降低,睡眠好轉時IL-1β升高。TNF-α一般由外周巨噬細胞、淋巴細胞和中樞星形膠質細胞產生，是一種具有多種生物學效應的細胞因子，在外周免疫反應、炎癥過程中起重要作用。TNF-α不但是免疫系統調節睡眠的中介，能促進神經遞質更新，調節睡眠；而且還能調節睡眠質量，顯著增加慢波睡眠所占比例[10]。研究［20］發現TNF-α能促進大鼠、小鼠腦內5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）合成，通過提高5-HT及其代謝產物5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)含量增強中樞神經系統5-HT功能，從而調節睡眠。也有研究證實，外源性IL-1β、TNF-α均可誘發動物睡眠[21]。病毒、細菌及應激等刺激可以誘發TNF-α釋放，TNF-α可以互相刺激互相誘導共同參與睡眠的調節。研究證實，良好的睡眠及健康的心態均激活免疫系統，促進單核細胞分泌IL-1β與TNF-α，從而改善睡眠節律[22]。

中醫認為本病主要在心，病機主要是陽盛陰衰，陰陽失交。胡曉靈主任醫師根據多年臨床經驗，以新疆地產中草藥薰衣草、紅景天為基礎，配合郁金、石菖蒲研制的景衣安神散，選擇神闕以及雙側內關、涌泉進行穴位貼敷治療失眠。紅景天與薰衣草具有耐嚴寒、抗干旱、易成活的特性，在新疆大量人工栽培。紅景天，性寒，味甘澀，歸肺、心經，具有扶正固本、調和陰陽、補氣清肺，益智養心的功效，現代藥理研究證實，可抗疲勞、耐缺氧、增強免疫、維持神經系統興奮和抑制的平衡、抗驚厥、鎮靜催眠［23］。薰衣草為維吾爾醫常用藥材，首載于阿維森納著《醫典》，偏溫，具有清腦安神，散寒止痛功效［24］。現代藥理研究證實［25］薰衣草具有抗菌、鎮靜催眠、抗驚厥、解痙、鎮痛及抑制變態反應等功效；郁金，味辛，性苦寒，入心、肝、膽、肺經，辛散苦降，具有行氣解郁，清心涼血、開竅化痰的功效；石菖蒲，辛苦溫，除濕化痰，醒腦開竅，二藥與薰衣草相須為用，能芳香化濕，豁痰開竅，解郁祛瘀，清腦定志。諸藥為散劑，通過貼敷內關、神闕及涌泉穴位刺激經絡，共奏補氣活血，理氣解郁，養心安神功效。前期臨床研究發現該藥可以延長失眠患者睡眠時間，改善失眠伴隨癥狀，改善日間功能障礙，提高睡眠質量和效率［26-28］。

本研究結果發現，造模后大鼠正常的睡眠-覺醒周期紊亂，模型組大鼠空曠實驗得分、中央格停留時間縮短，糞便顆粒增加（P＜0.01），修飾次數增加（P＜0.01）；大鼠掙扎次數增多，絕望時間延長（P＜0.01），表明模型組大鼠比較緊張、躁動、絕望，在一定程度上反映成功復制失眠模型。與模型組比較，實驗組大鼠空曠實驗得分、中央格停留時間以及糞便顆粒均減少（P＜0.01），修飾次數與掙扎次數減少，絕望時間縮短（P＜0.01），說明中藥穴位貼敷可以緩解大鼠的緊張程度，趨向安靜狀態，具有鎮靜催眠作用。

本實驗發現，與對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β與TNF-α含量均下降（P＜0.01）。治療后與模型組比較，實驗組失眠大鼠血清IL-1β以及TNF-α逐漸升高（P＜0.01）。證實中藥穴位貼敷可以使失眠大鼠血清IL-1β與TNF-α含量升高，誘導失眠大鼠睡眠，恢復正常的睡眠-覺醒周期，這可能與景衣安神散理氣解郁安神功效有關。