龍葵總堿對人骨髓瘤RPMI8226荷瘤裸鼠的抑瘤作用*

劉 凱，王 躍，聶 甜，郝敬全，黃 蓉，江勁波

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410208

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種惡性漿細胞腫瘤，占血液腫瘤的10%～15%，死亡率占血液系統(tǒng)惡性疾病的1/5，屬于病死率較高的難治性血液惡性腫瘤［1］。西醫(yī)采用以硼替唑米（bortezomib，BTZ）、來那度胺為基礎的誘導/鞏固化療方案能最大程度降低腫瘤負荷，但復發(fā)率高［2］，副作用較大［3］。近年來，本課題組在中醫(yī)辨證中加入龍葵用于骨髓瘤各證型的治療。龍葵總堿是龍葵中的活性生物堿。前期研究通過體外實驗方法證實了其具有誘導人多發(fā)性骨髓瘤細胞系RPMI8226凋亡的作用［4］。本研究通過體內(nèi)實驗檢測龍葵總堿對荷瘤小鼠骨髓瘤細胞的抑制作用，進一步探究龍葵總堿抗骨髓瘤的相關機制，為開發(fā)新型抗骨髓瘤藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞株4周齡SPF級BALB/c裸鼠90只，體質(zhì)量15～20 g，均為雌鼠，購自上海寶特生命科學發(fā)展有限公司［SYXK（湘）2013-0005］。RPMI-8226骨髓瘤細胞株（武漢興旺生物科技有限公司，批號：5078）。

1.2 主要藥物與試劑硼替佐米注射劑（西安楊森制藥有限公司，批號：160823591，規(guī)格：1.0 mg）；龍葵總堿（蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號：YXQ-511）；胎牛血清（Gibco公司，批號：SH30070）。

1.3 儀器與設備DYY-6C型電泳儀和WD-9405B型水平搖床（北京六一儀器廠）；THZ-82A型恒溫搖床（金壇榮華儀器制造有限公司）；MERCK MILLIPORE D24型紫外線超純水表（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；臺式高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；生物凈化工作臺（美國AIRTECH公司）；細胞培養(yǎng)箱（香港HEAL FORCE公司）；萬分之一電子天平（上海Ohaus公司）；HT-7800型透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)將RPMI-8226骨髓瘤細胞株加入含10%胎牛血清，加雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃、50% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期RPMI-8226骨髓瘤細胞，臺盼藍染色拒染率95%以上，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次后懸于1∶1混勻無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度為2×106/mL，收集細胞前一晚更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4.2 荷瘤裸鼠模型的建立與分組

1.4.2.1 建模除空白組外，其余各組裸鼠均采用劉瑜法［5］建立骨髓瘤移植小鼠模型，即SPF環(huán)境下在每只裸鼠右前肢外側皮下接種細胞懸液2×106/0.2 mL。造模成功標準：隨機取1只模型小鼠處死，取其瘤組織進行病理檢測，包括HE染色和免疫組織化學染色、血清免疫固定電泳。HE染色后可見大量原始、幼稚漿細胞聚集分布，免疫組織化學染色后可見漿細胞CD38（+）或κ、λ輕鏈（+），血清免疫固定電泳檢測到M蛋白。

1.4.2.2 分組將造模成功裸鼠隨機分成5組各15只。空白組與模型組灌胃生理鹽水10 mL/（kg·d），硼替佐米組皮下注射硼替佐米0.1 mg/（kg·d），龍葵總堿高、中、低劑量組分別灌胃龍葵總堿50、25、12.5 mg/（kg·d）。每日2次，每次0.1 mL，連續(xù)灌胃14天。

1.5 指標檢測

1.5.1 腫瘤組織觀察用15%的中性福爾馬林溶液固定腫瘤組織，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片（5 μm厚），按順序依次記錄各樣品對應包埋塊編號，用蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察薄膜，放大倍數(shù)為400；眼眶靜脈叢取血行免疫固定電泳及免疫分型檢測。

1.5.2 龍葵總堿體內(nèi)抑瘤作用最后1次灌胃后絕對禁食6 h，第2日斷頸處死裸鼠，解剖荷瘤裸鼠取腫瘤稱質(zhì)量，根據(jù)瘤質(zhì)量計算抑瘤率：

抑瘤率(%)=（模型對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型對照組平均瘤重×100%

另將瘤塊組織切小塊（按照實驗動物編號順序排列），液氮速凍，-80度保存。隔日測定瘤體積，腫瘤體積（mm3）=（a2×b）/2，公式中a為腫瘤寬度（mm）；b為腫瘤長度（mm）。

1.5.3 細胞形態(tài)觀察取出樣本用磷酸鹽沖洗液（PBS）清洗3次，10 min/次，靜置60 min，1%鋨酸后固定液固定1 h，PBS清洗3次，10 min/次；用50%～100%酒精逐級脫水，37℃條件下嵌入環(huán)氧樹脂Epon812和丙酮混合物（1∶1）浸泡和包埋1 h，包埋劑與丙酮混合液（3∶1）浸透，過夜；純包埋劑浸透24 h，然后進行包埋，在60℃條件下聚合48 h。Leica EM UC7超薄切片機切片，日立HT-7800透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，并且使用ANOVA模塊進行多組間比較。

2 結果

2.1 骨髓瘤小鼠模型建立接種人骨髓瘤細胞第5天后種植部位即可觸及新生組織，接種第10天后全部小鼠皮下開始出現(xiàn)腫塊，解剖出腫瘤組織行石蠟切片染色及血清免疫蛋白電泳、流式分型檢測，證實所取組織確為多發(fā)性骨髓瘤組織。見圖1—4。

圖1 成瘤裸鼠

圖2 瘤組織石蠟切片（HE×400）

圖3 免疫蛋白電泳結果κ輕鏈（+）

圖4 流式細胞表達CD38（+）與cKappa

2.2 龍葵總堿對荷瘤裸鼠瘤體積和瘤重的影響與模型組對比，龍葵總堿灌胃或硼替佐米注射荷瘤裸鼠，結果顯示龍葵總堿對裸鼠皮下移植瘤生長具有抑制作用。龍葵總堿低、中、高劑量組和硼替佐米組的瘤重及瘤體積較模型組減輕、變小，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；龍葵總堿中、高劑量組的抑瘤率分別為42.4%和53.8%，均高于低劑量組的19.2%（P＜0.01）。見表1。

表1 各組移植瘤瘤重、瘤體積和抑瘤率的比較

2.3 龍葵總堿對荷瘤裸鼠腫瘤細胞的影響模型組腫瘤細胞中存在大量原漿和幼漿細胞，腫瘤細胞體積大，細胞核呈藍紫色，細胞核大，染色質(zhì)濃縮在核膜下，深染并濃縮成塊狀，典型的有絲分裂細胞明顯。龍葵總堿高、中、低劑量組均出現(xiàn)不同程度的細胞破碎和凋亡，細胞排列呈不同程度的疏松狀，可見大片細胞壞死，而硼替佐米組細胞形態(tài)呈破碎狀，原漿和幼漿細胞明顯減少，細胞染色質(zhì)明顯疏松。見圖5。

圖5 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織細胞形態(tài)（×400）

2.4龍葵總堿對荷瘤裸鼠超微結構的影響模型組瘤細胞外形多數(shù)規(guī)則，細胞核多呈圓形或橢圓形，核內(nèi)常染色質(zhì)占優(yōu)勢，核仁明顯而大，胞漿多少不定，并出現(xiàn)自噬小體，細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極豐富。部分板層狀排列，且有不同程度的擴張，電子密度高低不等，線粒體及包涵體多少不一（圖6A）；龍葵總堿低劑量組瘤細胞出現(xiàn)皺縮，細胞質(zhì)出現(xiàn)濃縮，電子密度中度，線粒體數(shù)量減少，核內(nèi)異染色質(zhì)在周邊及異質(zhì)中部分凝集成塊（圖6B）；龍葵總堿中劑量組瘤細胞體積進一步縮小，細胞染色質(zhì)固縮，核邊集，細胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松形成空泡，并開始出現(xiàn)自噬細胞（圖6C黑色箭頭所指）。龍葵總堿高劑量組細胞呈晚期凋亡形態(tài)，已無完整的細胞膜，骨髓瘤細胞周圍出現(xiàn)大量的自噬細胞（圖6D）。

圖6 TEM下各組瘤細胞超微結構（×10000）

3 討論

龍葵味苦、微甘，《藥性論》載其有清熱解毒、活血散瘀之功，龍葵總堿是龍葵中分離出來的甾體生物堿［6］，廣泛存在于馬鈴薯、番茄及茄子等茄科植物組織和器官中。AKSHATHA等［7］通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，龍葵堿具有誘導肝細胞癌的凋亡作用。另有研究證明，對胃癌［8］、白血病［9］等具有廣泛抗腫瘤活性。劉新民等［10］研究表明：龍葵堿能夠改變腫瘤細胞ATP酶的活性、阻斷NF-κB信號通路的介導等諸多媒介來改變細胞膜結構與作用，最終實現(xiàn)抗瘤目的。顧錦華等［11］觀察復方龍葵膠囊對荷瘤小鼠的作用，結果顯示實驗藥物可促進S180肉瘤細胞凋亡。但目前國內(nèi)外對龍葵總堿在誘導多發(fā)性骨髓瘤凋亡方面的報道相對較少。本課題組將龍葵廣泛用于漿細胞骨髓瘤的各階段治療，結果表明能減少MM患者的腫瘤負荷，降低血清M蛋白含量，提高抗骨髓瘤療效［12］。通過體外實驗證明龍葵總堿可以抑制骨髓瘤RPMI-8226細胞NF-κB表達，呈藥物濃度與時間依賴性，促骨髓瘤細胞凋亡作用明顯［4］。

本研究結果顯示龍葵總堿對荷瘤裸鼠的骨髓瘤細胞具有明顯抑制作用，呈劑量依賴性。近年來，隨著細胞遺傳學與分子遺傳學的不斷深入，臨床將誘導腫瘤細胞凋亡視為骨髓瘤治療有效的重要途徑。在觀察龍葵總堿對骨髓瘤荷瘤小鼠細胞凋亡影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，透射電鏡下不同劑量龍葵堿組腫瘤細胞圖中均出現(xiàn)胞質(zhì)空泡樣變，核固縮以及明顯的凋亡小體，隨著龍葵總堿劑量的提高，自噬小體數(shù)量升高，自噬活性可能被上調(diào)，故引起骨髓瘤細胞凋亡的機制可能為龍葵總堿引起的強烈自噬減弱了骨髓瘤細胞的生存力。自噬在骨髓瘤細胞凋亡中起雙刃劍作用［13］。一為抑制自噬誘導MM細胞凋亡，硼替佐米作為一種重要的抗骨髓瘤藥物，目前認為其誘導骨髓瘤細胞凋亡的機制之一在于抑制未折疊或者錯誤折疊蛋白的降解，引起持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡級聯(lián)反應，進而促使細胞調(diào)亡。二為促進細胞自噬，當過度自噬時則有可能導致細胞死亡，即自噬性死亡。ZISMANOV等［14］團隊證實細胞膜蛋白CD81和CD82在被重新轉染表達于骨髓瘤細胞時，能致使細胞凋亡，而其根本途徑由自噬性死亡執(zhí)行。地塞米松是治療MM的主要藥物之一，其與硼替佐米聯(lián)合使用時促使細胞自噬水平顯著增強，進而擴增殺傷多發(fā)性骨髓瘤細胞［15］。

本研究結果為開發(fā)以龍葵總堿為主要成分的抗骨髓瘤靶點新藥提供了實驗基礎，下一步研究將通過體內(nèi)實驗探究龍葵總堿如何調(diào)節(jié)相關基因促進骨髓瘤細胞凋亡。