芪麝丸對背根節(jié)神經元COX2-PGE2-EP信號通路影響的體外研究*

陳蘋華，唐占英，劉 丹，袁薇娜，李 攀，胡志俊

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海230000

神經根型頸椎病往往是由頸背根神經節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）或脊神經后根（dorsal root，DR）受到傷害性刺激所產生的以疼痛、麻木為主的綜合征，有學者[1]曾采用WHOQOL-BREF量表（世界衛(wèi)生組織生活質量測定量表簡表）追蹤調查了神經根型頸椎病患者不同維度的生活質量，研究發(fā)現生理領域得分最低，并且隨著病程的延長，其得分越低，由此可見，神經根受壓所帶來的一系列癥狀，如頸部伴上肢的麻木、疼痛、感覺異常等嚴重并長期影響著人們的生活質量。其病理變化多為脊神經節(jié)受到機械壓迫或炎性因子刺激等而引起的缺血、水腫等神經功能異常，屬于根性神經痛的一種。DRG在根性神經痛中起不可或缺的作用。DRG神經元不僅可以自身釋放炎性介質，存在于其膜上的離子通道也介導痛覺異常的發(fā)生發(fā)展。芪麝丸是基于施杞教授提出的“以氣為主、以血為先”的理論而研發(fā)的中成藥，由黃芪、川芎、人工麝香、青風藤、防己和人工牛黃為主要成分制成，主要用于治療氣虛血瘀型神經根型頸椎病。本研究基于環(huán)氧合酶2-前列腺素E2的受體（cyclooxygenase 2-prostaglandin E2-E-prostanoid，COX2-PGE2-EP）信號通路探究芪麝丸對DRG的影響，進一步驗證芪麝丸對根性神經痛的臨床療效。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD大鼠1周齡（雌雄不限），體質量（23±3）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：2007000542991，動物實驗場所合格證號：上海中醫(yī)藥大學動物實驗室（SYXK滬2003-0002）。

1.2 藥物芪麝丸（上海黃海制藥有限責任公司，批號：161101，規(guī)格：25丸/袋）。

1.3 主要試劑DMEM/F-12培養(yǎng)基（1∶1）（上海源培生物科技股份有限公司，F40515/L320KJ）；0.25%胰蛋白酶EDTA溶液（上海源培生物科技股份有限公司，CA4061/S310KJ）；青霉素-鏈霉素溶液（碧云天生物技術有限公司，100X，1709239/030311B）；阿糖胞苷（Macklin公司）；胎牛血清（Gibco公司，1715752/10099141）；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α，上海鑫樂生物，1707JZ31rMH/xlEr0359）；Super Script VILO cDNA Synthesis Kit、PowerUp SYBR Green Master Mix（vazyme，7E252D8/R12301）；Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒A/B（日本TaKaRa公司，A4801A/T9300A1、A1101B/T9300A2）；PTGS2(COX-2)Antibody COX2抗體（boster公司，31296I11P56/ba0738）；Anti-Prostaglandin E Receptor EP4抗體（abcam公司，GR2738291/ab93486）。

1.4 主要儀器SZX7型體視顯微鏡（Olympus奧林巴斯公司）；HFsafe-1500LC型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；371型CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；TDZ5-WS型臺式低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；IX73型倒置相差顯微鏡（Olympus奧林巴斯公司）；ViiA7型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）；Spectramax plus384型酶標儀（江蘇美達實驗室設備有限公司）；AI600型Western掃膜系統（General Electric公司）。

1.5 芪麝丸藥液的配制將芪麝丸與DMEM/F-12培養(yǎng)基按照1 g/2 mL的比例加入到2 mL離心管中，勻漿機中勻漿，并充分混勻；37℃條件下水浴2 h；4℃冰箱內靜置24 h；過200目，70 μm的細胞過濾器過濾除菌，制成母液，濃度為50%，分裝保存于-20℃的冰箱內。

1.6 芪麝丸藥液濃度的篩選收集背根節(jié)神經元，分別加入0.5%、0.35%、0.25%和0.1%4個濃度梯度的芪麝丸藥液，結果顯示0.35%的芪麝丸對背根節(jié)神經元的毒性作用小，可以有效抑制DRG神經元中COX2-PGE2-EP信號通路中環(huán)氧合酶2的信使核糖核酸(cyclooxygenase 2 messenger RNA，COX2 mRNA）、EP2 mRNA、EP4 mRNA和 環(huán) 氧合酶2(cyclooxygenase，COX2）蛋白、EP4蛋白的表達，故本實驗選擇最佳濃度為0.35%的芪麝丸藥液。

1.7 背根節(jié)取材、培養(yǎng)與分組

1.7.1 背根節(jié)取材與培養(yǎng)1）無菌條件下解剖并游離大鼠脊柱，沿著脊柱前、后正中線剖開成兩部分，并向兩側翻開；2）在體視顯微鏡（40×）下，輕牽拉脊髓翻向外側，可在脊柱內部側方的凹槽內發(fā)現一膨大結構，即DRG；3）分離周圍組織，盡可能留下膨大部分，即得到完整的背根節(jié)；4）用0.25%胰蛋白酶EDTA消化，接種于6孔板中，標記為對照組、模型組和芪麝丸組，放入36℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱孵育。定時換液，培養(yǎng)48 h后加入10 μmol/L的阿糖胞苷溶液純化，第7天時收集細胞備用。

1.7.2 分組將培養(yǎng)的DRG神經元分為對照組、模型組和芪麝丸組。對照組不施加干預因素；模型組加入100 ng/mL的TNF-α溶液；芪麝丸組加入100 ng/mL的TNF-α溶液及0.35%的芪麝丸藥液。

1.8 檢測指標

1.8.1 背根節(jié)COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的檢測制備并分選背根節(jié)神經元，接種于6孔板中，各組干預后于第7天收集細胞，采用實時定量熒光聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，PCR法）檢測COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的表達。

1.8.2 背根節(jié)COX2蛋白、EP2蛋白、EP4蛋白的檢測制備并分選背根節(jié)神經元，接種于6孔板中，各組干預后于第7天收集細胞，采用蛋白質印跡法（Western Blot）法檢測COX2蛋白、EP4蛋白的表達。

1.9 統計學方法使用SPSS 21.0統計軟件分析數據，在正態(tài)性和方差齊性下采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以±s表示，組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統計學意義；不滿足條件的數據采用非參數檢驗，以中位數M表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 離體培養(yǎng)的背根節(jié)神經元對照組DRG神經元胞體較大，呈橢圓形，胞體中間顏色深，邊緣顏色較淡，呈透明狀光暈樣；DRG神經元有的呈單個散在分布，有的聚集成島狀；DRG神經元發(fā)出神經纖維軸突較粗，相互連接交互形成神經網狀結構；散見少量呈紡錘形的雪旺細胞以及形狀不規(guī)則的成纖維細胞。模型組加入100 ng/mL TNF-α溶液后，DRG神經元發(fā)出的神經軸突聚集成簇狀分布，神經元胞體也聚集成島狀，數目相對減少；加入中藥芪麝丸藥液后，DRG神經元胞體多呈串珠樣分布，胞體顏色加深，神經纖維網絡較前稀疏，但神經纖維增粗。見圖1。

圖1 各組DRG神經元變化情況

2.2 各組背根節(jié)神經元中COX2-PGE2-EP信號通路表達情況模型組中COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的表達均有所增加，COX2蛋白和EP4蛋白表達上調；與對照組比較，COX2 mRNA的表達差異具有統計學意義（P＜0.05），EP4蛋白表達差異顯著（P＜0.01）；EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），提示TNF-α成功誘導背根節(jié)神經元發(fā)生“炎癥性改變”。與模型組比較，芪麝丸組DRG神經元中COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA表達下降，其中COX2 mRNA表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，芪麝丸組DRG神經元中COX2蛋白和EP4蛋白含量有所降低，其中EP4蛋白表達差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表1、圖2—3。

表1 各組背根節(jié)神經元COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白和EP4蛋白的表達情況（±s）

表1 各組背根節(jié)神經元COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白和EP4蛋白的表達情況（±s）

注：與對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.05，△表示P＞0.05

?

圖2 對照組與模型組大鼠DRGns中蛋白表達

3 討論

根性神經痛是臨床常見的一種病情復雜、反復發(fā)作的慢性疼痛類疾病。主要是由于DRG或DR受到傷害性刺激而產生疼痛癥狀，往往由于脊神經后根，特別是脊神經節(jié)受到機械壓迫或炎性因子刺激而引起的一種病理變化。

無論是椎間盤突出［2］、腫瘤壓迫占位或者是外周神經炎癥反應等，都能夠造成DRG和DR損傷，受損的DRG和DR可在局部產生大量相關的神經遞質和炎性因子，主要包括COX2、前列腺素E2（PGE2）［3］和TNF-α等。其中COX2限速酶能夠促進花生四烯酸合成PGE2，以此結合并激活PGE2的4個G蛋白偶聯受體EP1、EP2、EP3和EP4，進一步誘發(fā)炎癥和根性神經痛的發(fā)生。

圖3 模型組與芪麝丸組大鼠DRGns中蛋白表達

研究發(fā)現，TNF-α可以通過誘導COX2、PGE2和EP表達增加激活COX2-PGE2-EP信號通路。在SNI大鼠脊髓小膠質細胞中，TNF-α mRNA短暫性表達增加，24～48 h后COX2和PGI2合成酶含量在內皮細胞中增加；鞘內注射TNF-α可以增加內皮細胞中COX2和PGI2合成酶mRNA的含量，這些發(fā)現表明神經損傷后脊髓小膠質細胞中產生的TNF-α可能誘導COX2和前列腺素類合成酶產生，進而參與神經性痛的產生［4］。在非神經細胞中，如纖維母細胞，TNF-α可在不同時間點誘導產生COX2和PGE2［5］；在人羊膜細胞中，在外源性花生四烯酸存在的條件下，TNF-α可以持續(xù)誘導產生PGE2［6］；如人類上皮細胞中加入TNF-α后，可呈劑量和時間依賴性誘導COX2和PGE2的表達［7］。由此可認為TNF-α能夠通過不同機制誘導COX2和PGE2的表達，參與神經病理性疼痛的發(fā)生。

中醫(yī)古籍中并無根性神經痛的相關記載，臨床常見的根性神經痛如神經根型頸椎病可根據其癥狀歸于“痹癥”范疇。施杞教授認為慢性筋骨病屬中醫(yī)“痹癥”范疇［8］，并創(chuàng)立了“益氣化瘀方”的代表方劑芪麝丸。王擁軍等制備長期直立大鼠模型，發(fā)現模型組大鼠L5椎體邊緣發(fā)生骨質增生改變，受壓的椎間盤與上下位椎體之間非基質成分含量增加，Ⅰ型和Ⅲ型膠原增加，同時X型膠原蛋白（type X collegan，Col X）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及轉化生長因子β1（transform growth factorβ1，TGF-β1）表達增強，芪麝丸干預后能夠降低Col X和VEGF的表達量和椎間盤膠原α1（collagenα1，Col10α1）及相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）基因的表達［9-10］。芪麝丸干預氣虛血瘀型大鼠模型后，能夠下調高表達的磷脂酶A2（PLA2）和PGE2水平，延長其游泳時間?？梢哉J為芪麝丸能改善氣虛血瘀型大鼠癥狀［11］。因神經根型頸椎病多為突出的椎間盤或增生的骨贅壓迫刺激脊神經根產生炎癥，故在體外培養(yǎng)炎性細胞-巨噬細胞模擬神經根型頸椎病的炎性環(huán)境，發(fā)現芪麝丸能夠通過減少NO含量和COX2蛋白表達［12］進而抑制炎癥反應。與其他藥物相比，芪麝丸能夠有效改善患者頸痛、上肢麻木的癥狀，且不良反應少［13-16］。

本實驗在離體培養(yǎng)的DRG神經元中加入TNF-α模擬體外DRG或DR受壓的炎性環(huán)境。發(fā)現TNF-α可以促進COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA和COX2蛋白、EP4蛋白的表達，而芪麝丸藥液能夠在一定程 度 上 抑 制COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA和COX2蛋白、EP4蛋白表達，提示芪麝丸可以通過調控背根節(jié)COX2-PGE2-EP信號通路發(fā)揮抗炎、改善局部水腫等緩解根性神經痛的作用。