針刺對短暫性全腦缺血再灌注大鼠自噬相關蛋白的影響*

徐雅文，董蓉潔，毛 斌，尹艷艷，趙俊杰

蓬萊市中醫院，山東 蓬萊265600

全腦缺血性損傷是心臟驟停后死亡的主要原因。成功復蘇的患者中院內死亡率為70%，而2/3的幸存者在3個月內會出現中度或重度神經功能缺損體征［1］。由于現有的治療方法很難解決其所致的大量神經細胞損傷或死亡，即使是短暫的大腦血液供應中斷也會導致嚴重的腦損傷和不可逆轉的認知和執行功能障礙［2-3］。研究表明［4-6］，針刺能從抑制炎癥反應及細胞凋亡、減輕過氧化反應、促進血管再生多途徑多角度改善腦缺血大鼠神經功能體征，進而起到保護神經細胞與促進神經功能修復的作用。大量體外或在體實驗證明自噬參與了腦缺血腦損傷的病理過程，對于維持細胞正常功能有重要意義，其激活或抑制影響細胞的生存和死亡［7］。本研究通過制備短暫性全腦缺血再灌注（TGCIR）大鼠模型，觀察針刺百會、大椎穴對TGCIR大鼠腦組織自噬相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組本研究遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定，使動物遭受痛苦達到最小。選用成年雄性SD大鼠（200～300 g），實驗動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001，在SPF級動物實驗室飼養［溫度（22±2）℃，光暗周期12 h/12 h，相對濕度（60±5）%］。將54只大鼠隨機分為模型組、非穴位組及針刺組各18只。每籠飼養6只（70 cm×43 cm×27 cm），提供標準飲食飲水。

1.2 儀器與試劑SC600C型有創血壓監測儀（Siemens，德國）；反饋式溫度調節儀（Harvard Apparatus，美國）；CUT4062型石蠟切片機（SLEE，德國）；ASP300型自動脫水機（LEICA，德國）；IX71型顯微鏡（Olympus，日本）；002421型低溫離心機（Thermo Fisher Scientific，美國）；EPS-300型電泳儀（上海天能科技有限公司）；華佗牌針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司，規格：0.25 mm×25 mm）。恩氟烷（河北一品制藥股份有限公司，批號：H13023176）；PBS緩沖液（武漢博士德生物有限公司，AR0030）；多聚甲醛（武漢博士德生物有限公司，AR1068）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天試劑盒，P0012S）；PVDF膜（上海士鋒生物科技有限公司，F0141）；LC3B（北京博奧森生物有限公司，bs-2912R-1）；Beclin 1（北京博奧森生物有限公司，bs-1353R-1）；兔抗β-actin多克隆抗體（sc-8432，Santa Cruz Biotechnology，美國）；羊抗兔IgG（Abcam，ab6721，英 國）；FITC（sc-65218，Santa Cruz Biotechnology，美國）。

1.3 短暫性全腦缺血再灌注模型制備方法根據Atochin等提出的改良三血管閉塞法［8］制備大鼠TGCIR模型。所有手術均在無菌條件下進行，應用面罩吸入氣體麻醉（1.5%恩氟烷混合30%O2/70%N2O）大鼠，暴露右側股動脈，將動脈插管插入血管，連接壓力換能器，動態檢測血壓。同時檢測肛溫，將大鼠放于恒溫毯上維持體溫36～37℃。局部皮膚消毒、備皮，以胸骨柄皮膚為橫切口，切口長2 cm延伸到左邊和右邊的第一個肋間隙。通過頸腹面進入頸總動脈，通過第一肋間隙到達頭臂干和左鎖骨下動脈，繞過胸膜腔避免氣胸。結扎供應大腦的主要動脈（頭臂干動脈、鎖骨下動脈、頸總動脈），使腦血流完全中斷7 min。總手術干預時間30～40 min。局部消毒后逐層縫合皮膚，待大鼠蘇醒后放入飼養籠中觀察。見圖1。

圖1 大鼠短暫性全腦缺血再灌注血管結扎部位示意圖

1.4 模型制備成功評價標準大鼠造模蘇醒后，參照Garcia［9］4分制評分評估大鼠自發性活動情況，將蘇醒大鼠單獨放置于飼養籠內，觀察大鼠5 min內接觸籠子四面的情況。0分：大鼠基本不活動；1分：大鼠僅能輕微移動不能接觸籠子任何一面；2分；大鼠可以運動，僅輕微影響運動，接觸籠子少于3個面；3分：大鼠可以隨意運動，并至少接觸3個面。最終納入評分為0～1分表示造模成功。

1.5 干預方法

1.5.1 模型組接受短暫性全腦缺血再灌注模型制備，但不給于任何治療干預。

1.5.2 針刺組根據《實驗針灸學》［10］中穴位定位標準，大鼠造模蘇醒后選取0.25 mm×25 mm針灸針針刺百會穴（頂骨正中）、大椎穴（第7頸椎與第1胸椎間），針刺深度13 mm，每天2次，每12 h1次，共3天，以180～220 r/min捻轉5 min，每5 min捻轉1次，共捻轉3次，留針30 min。

1.5.3 非穴位組大鼠造模蘇醒后選取0.25 mm×25 mm針灸針，取患側非穴位（定位：百會穴、大椎穴各旁開1 cm，平行百會、大椎穴連線）針刺深度2～3 mm，不行手法，盡量減少刺激量，留針30 min。

1.6 觀察指標

1.6.1 神經功能缺損評分［11-12］分別于造模前及造模后72 h評估大鼠神經功能缺損評分。觸須誘導測試：輕握大鼠軀干部位，緩慢移動大鼠至其胡須接觸操作平臺邊緣。正常大鼠在胡須被刺激時同側前肢會放置在操作臺邊緣。測試重復10次，得分=前肢成功放置次數/總次數×100%。復合神經功能評分：參照Belayev 12分制評分法，共6個條目，得分越高表示神經功能損傷越嚴重。

1.6.2 組織灌注與取材針刺干預3天行為學評估結束后進行灌注取材，大鼠腹腔倍量注射3%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）進行麻醉。快速取腦組織于液氮中保存，用于Western blot檢測（每組6只）及置于-20℃冰箱10 min用于TTC染色（每組6只）；4%多聚甲醛心臟內灌注，剝離取腦組織，并保存于4%多聚甲醛固定液中，用于免疫組化學檢測（每組6只）。

1.6.3 TTC染色將大鼠大腦置于腦模具內自前向后均勻切為7～8片，每片厚2 mm，并放置于TTC染液中，白色為梗死腦組織，紅色為正常腦組織。于4%多聚甲醛中固定24 h。

相對梗死體積=微梗死體積/總體積=（S1+S2+S3+…SN）H/（S1總＋S2總＋…SN總）H，SN表示每片的梗死面積，H表示每片厚度。

1.6.4 免疫組化檢測切片（4 μm）常規脫蠟至水，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次；枸櫞酸溶液（0.1 mol/L、PH=6.0）中熱抗原修復，水浴20～25 min，室溫冷卻30 min，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次；加入封閉液室溫封閉20 min；去除封閉液后（勿洗）加入適當比例一抗稀釋液（1∶1 000，LC3），4℃孵育過夜；PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次，加入適當比例二抗稀釋液（1∶500，FITC），室溫孵育2 h；PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次；加入DAB顯色液，封片，鏡檢。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析不同高倍鏡視野圖像熒光強度。

1.6.5 Western blot檢測腦組織樣本中加入RIPA裂解液，低溫高速離心提取組織上清液，BCA試劑盒測定蛋白含量，電泳、PVDF轉膜、脫脂牛奶封閉，加入一抗稀釋液（1∶1 000，LC3；1∶1000，Beclin 1，1∶2 000，β-actin）4℃過夜，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次，加入HPR標記二抗稀釋液（1∶2 000，羊抗兔IgG）室溫孵育2 h，PBS（0.01 mol/L）洗3 min×3次，ECL發光液顯色。采用Image-Pro Pus 6.0圖像分析軟件計算相對蛋白表達量。

1.7 統計學方法采用SPSS 21.0軟件分析數據，計量資料以±s表示，兩組間采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學評分造模后72 h，與基線比較，模型組大鼠出現較嚴重的神經功能缺損（P＜0.05），非穴位組與模型組比較無明顯差異，針刺百會、大椎穴能改善大鼠神經功能評分（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠行為學評分比較

2.2 大鼠相對腦梗死體積與模型組比較，非穴位組大鼠相對腦梗死體積無明顯差異，針刺組大鼠相對腦梗死體積降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠相對腦梗死體積比較

2.3 大鼠CA1區LC3免疫熒光染色陽性表達綠色熒光為LC3陽性細胞著色。模型組與非穴位組比較LC3免疫熒光強度無明顯差異，而針刺組LC3免疫熒光強度高于模型組與非穴位組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠CA1區LC3免疫熒光染色陽性表達（×400）

2.4 大鼠LC3、Beclin 1蛋白比較與模型組比較，非穴位組LC3、Beclin 1蛋白無明顯差異。而針刺組可提高LC3、Beclin 1蛋白表達（P＜0.05），差異具有統計學意義。見圖5。

圖5 各組大鼠LC3、Beclin 1蛋白表達（Western blot）

3 討論

自噬（autophagy）是一種高度保守的細胞行為，主要涉及大分子物質在細胞中的循環和再利用，參與降解受損的細胞器，維持細胞內環境的動態平衡，對腦缺血受損神經細胞的“存活”與“毀滅”意義重大［13-14］。調控自噬機制是較為復雜的過程，其中LC3（Atg8）、Beclin1（Atg6）蛋白是檢測自噬活性的重要指標［15］。LC3存在兩種可相互轉化的形式LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，游離形式的LC3Ⅰ通過泛素化修飾后脂化的膜結合形式的LC3Ⅱ。自噬體的數量與LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例成正比，能反映自噬活性，并可通過蛋白印跡技術計算LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值來反映自噬活性的高低［16-17］。Beclin1在哺乳動物細胞中廣泛表達，主要作為一種支架蛋白聚集并調節Beclin 1與ClassⅢPI3K/VPS34相互活性，并不斷招募自噬相關蛋白來介導自噬啟動，在多個階段對自噬起嚴格控制作用［18］。

近年來，越來越多研究證實腦缺血誘導的腦損傷可激活自噬溶酶體途徑，通過降解受損細胞器、炎癥物質、損傷線粒體等發揮神經保護作用［19-20］。最初通過透射電子顯微鏡觀察自噬體結構，并證實自噬參與了腦缺血病理過程。研究者進一步采用藥理學工具或基因敲除小鼠來研究自噬的誘導或抑制，并驗證了功能性自噬在腦缺血中的生物學意義［21］。在缺血損傷期間，激活的AMPK通過磷酸化抑制mTOR通路上調自噬，從而在缺血期間對細胞存活起保護作用［22］。在腦缺血大鼠模型中發現［23］，從2 h開始細胞自噬被顯著激活，1～6 h仍維持較高水平，24 h自噬達高峰。Carloni等［24］發現新生大鼠腦缺血后在短時間內可誘導自噬發生，應用3-MA自噬抑制劑可導致細胞大量凋亡、死亡，而應用雷帕霉素自噬激動劑可減少細胞凋亡及死亡數目，并通過mTOR通路發揮神經保護作用。可見，自噬可保護神經細胞，減輕缺血性損傷。自噬可能是拮抗腦缺血再灌注腦損傷的干預新靶點。

本研究采用改良三血管閉塞法制備短暫性全腦缺血再灌注大鼠模型，并通過2種常用行為學評分評估針刺百會及大椎穴對TGCIR大鼠神經功能缺損程度的影響。針刺療效主要有特異效應和非特異效應，前者為真實治療效應，后者為安慰劑效應［25-26］。本研究選取非穴位淺刺作為對照，其特異效應較弱，能體現針刺穴位的治療效應。結果表明，針刺穴位較非穴位能提高腦缺血大鼠神經功能缺損體征。說明針刺百會及大椎穴具有一定的穴位特異性。研究表明［27］，缺血過程中組織低氧、酸化、錯誤折疊蛋白、氧化應激及能量供應障礙是誘導自噬激活的重要因素，而自噬激活與腦損傷程度呈正相關。本研究中針刺百會及大椎穴能提高TGCIR大鼠腦組織自噬蛋白（LC3、Beclin 1）表達，提高自噬水平，表明針刺百會及大椎穴可能激活TGCIR大鼠腦組織自噬水平，改善神經功能缺損。

綜上所述，針刺百會及大椎穴能激活短暫性全腦缺血再灌注大鼠自噬，上調相關蛋白LC3、Beclin 1表達，改善腦損傷大鼠神經功能缺損。