基于網絡藥理學的新型冠狀病毒肺炎核心中藥靶標預測及其作用機制研究*

李 磊，寧南義，王小龍，張賀廷，李天發，邢昭雪，巫祥宇

阜陽市中醫醫院，安徽 阜陽236000

WHO將新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的全球傳播風險和影響風險級別由“高”上調為“非常高”［1］。國家衛生健康委員會印發了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［2］。該方案指出，COVID-19主要表現為發熱、干咳、乏力，少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛及腹瀉等癥狀；重癥患者多在發病1周后出現呼吸困難和/或低氧血癥，嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官功能衰竭等［3］。該病屬中醫“疫病”范疇，病因為感受“疫戾”之氣。中醫對“疫病”認識較早，如清代秦之楨《傷寒大白·卷四·疫病》中記載：“疫癥之原不一，如春時應暖而反寒，則有寒疫。冬時應寒反溫，則有溫疫……六氣之不正者，皆能發疫也。”本研究借助網絡藥理學方法篩選治療COVID-19處方中核心中藥的活性分子及潛在靶標，進一步分析其作用機制。

1 資料與方法

1.1 處方來源處方由2020年2月安徽省省級中醫專家組及阜陽市中醫醫院派駐阜陽市第二人民醫院參與治療COVID-19的專家開具，阜陽市中醫醫院藥劑科負責審核、調配、煎煮；經篩選，共整理出相關處方200張；處方涵蓋了不同年齡層次人群，具有一定代表性。

1.2 中藥名稱規范化處理中藥名稱不規范給臨床及科研工作帶來諸多不便［4］。本研究參考2015版《中華人民共和國藥典》及《中藥學》［5］教科書對處方中的藥名進行統一化處理，保證藥名一致。中藥拉丁名以《中藥鑒定學》［6］教材及南京中醫藥大學中藥標本中心（Chinese medicine specimen center ofNanjing University of Chinese Medicine，http：//zybb.njucm.edu.cn/）規范為準。

1.3 核心中藥篩選將規范名稱后的中藥逐一錄入Microsoft excel軟件，建立治療COVID-19的中藥處方數據庫；使用篩選、統計、數據透視等方法過濾處方高頻藥物，并進行可視化處理。

1.4 中藥活性分子過濾及相應基因預測以OB≥30%，DL≥0.18為過濾條件，在計算系統生物學實驗室TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http：//tcmspnw.com）過濾高頻中藥活性分子，剔除缺少靶標預測數據項。同時篩選高頻中藥相關基因，建立化合物-基因數據庫。根據高頻中藥活性成分在數據庫中篩選相應基因。應用UniProt KB（Universal Protein Knowledgebase，https：//www.uniprot.org/）數據庫整理基因名稱。

1.5 COVlD-19相關基因的篩選及中藥-疾病靶基因預測以“Novel Coronavirus Pneumonia”“NCP”為關鍵詞，分別從人類基因數據庫（Gene-Cards，https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，Online Mendelian Inheritance in Man，https：//omim.org/）中尋找疾病相關基因，建立COVID-19基因數據庫。取疾病相關基因與中藥相應基因的交集，獲得中藥治療COVID-19的潛在靶基因，并繪制文恩圖。

1.6 中藥-活性分子-靶基因-疾病網絡圖構建將中藥-疾病潛在靶基因、活性分子等導入Cytoscape-v3.7.2軟件生成網絡圖。對圖中各節點加上屬性進行整理后獲得中藥-活性分子-靶基因-“COVID-19”的調控網絡圖。

1.7 蛋白-蛋白相互作用網絡（PPl）的構建及關鍵靶標篩選利用STRING（https：//string-db.org）數據庫，對中藥-疾病潛在靶基因進行蛋白-蛋白相互作用網絡構建；根據鄰接節點數目對潛在靶基因進行排序整理，過濾關鍵靶標，繪制柱狀圖；并將鄰接節點≥42的關鍵靶標活性分子及所屬中藥列表展示。

1.8 GO功能富集分析及KEGG通路分析對獲得的中藥-“COVID-19”潛在靶基因進行靶點基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 核心中藥200張處方中共使用中藥136味，合計3418味次。使用頻次＞100的有17味，排名前5味的分別為茯苓（Poria）、甘草（Glycyrrhizae Radix Rhizoma）、陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium）、白 術（Atractylodis Macrocephalae Rhizoma）、半夏（Pinelliae Rhizoma）。除白術外，均為二陳湯（宋代《太平惠民和劑局方》）組成中藥［7］。尸檢報告結合相關文獻提示，痰濕既是COVID-19致病因素，又是病理產物，對該病形成的危害較大。二陳湯為治療痰濕證的基礎方，在COVID-19的治療中有重要意義［8-9］。故將半夏、茯苓、陳皮、甘草（二陳湯）納入本研究；頻次排名前17味的中藥見表1，可視化展示見圖1。

表1 使用頻次＞100的17味高頻中藥

圖1 使用頻次＞100的17味高頻中藥

2.2 中藥活性分子過濾及相應靶基因預測基于上述篩選條件，通過TCMSP平臺共過濾出半夏活性分子13個，陳皮活性分子5個，茯苓活性分子15個，甘草活性分子92個。根據搜集到的活性分子，在化合物-基因數據庫中尋找相應靶點，共獲得4味藥相關靶基因223條。

2.3 COVlD-19相關基因篩選及中藥-疾病靶基因預測根據限定關鍵詞，在GeneCards數據庫尋找到相關基因369條，OMIM數據庫尋找到相關基因2條。去重整理后共獲得COVID-19相關基因364條。取COVID-19的相關基因與核心中藥相關靶基因的交集，得到二陳湯治療COVID-19的潛在靶標52條。見圖2。

圖2 二陳湯治療“COVID-19”潛在靶標

2.4 核心中藥-活性分子-靶基因-“COVlD-19”的網絡圖構建將二陳湯-疾病的52條潛在靶標匹配中藥關鍵活性分子、節點屬性、網絡連線等，并導入Cytoscape軟件生成網絡圖。經賦予各節點、連線屬性，進一步整理，獲得二陳湯-活性分子-靶基因-“COVID-19”的調控網絡圖，將二陳湯中4味中藥分別予以展示，見圖3。圖中共547條網絡連線，153條節點屬性。包含疾病COVID-19，半夏、茯苓、陳皮、甘草4味中藥，映射出96個活性分子，52個潛在靶標。網絡圖外圈、內圈為活性分子，圈內包含相應靶標、疾病COVID-19以及4味核心中藥。

圖3 中藥-活性分子-潛在靶標-疾病網絡圖

2.5 PPl網絡構建及關鍵靶標篩選利用STRING數據庫對52條潛在靶標進行PPI網絡構建。圖中節點表示靶基因，綠色、紅色、深藍色、黃色、黑色、淺藍色連線分別代表基因鄰接、基因融合、基因共進化、蛋白互作、共表達關系、蛋白同源性。網絡圖中共有52個節點，771條邊，平均節點度值為29.7，平均局部聚類系數為0.785（圖4-1）。依據鄰接節點數目對靶基因進行排序，過濾關鍵靶基因（圖4-2）。鄰接節點數目≥42的核心靶標有8條，進一步匹配其相應活性分子。核心靶標分別為胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）、重組人白細胞介素1β（recombinant human IL1B protein，IL1B）、促分裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、促分裂原活化蛋白激酶3（mitogenactivated protein kinase 3，MAPK3）、促分裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、信號傳導子和激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），作用較強的活性分子有baicalein（黃芩苷）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、naringenin（柚皮素）、nobiletin（川橙皮素）、kaempferol（山柰酚）、licochalcone a（甘草查爾酮A）、quercetin（槲皮素）。見表2。

表2 中藥-活性分子-關鍵靶基因

圖4 -2關鍵靶基因

圖4 -1蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡圖

2.6 GO功能注釋及KEGG代謝通路富集分析對上述52個潛在靶基因進行GO富集分析，并根據P值大小對富集結果進行排序，進一步對生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）進行可視化展示［10］。52個潛在靶基因可能參與了氧化應激反應、細胞對生物刺激的反應、細胞因子產生的正向調節、凋亡信號通路的調控、凋亡信號通路的負調控、外源性凋亡信號通路、DNA結合轉錄因子活性調節、炎癥反應調節等生物過程，見附表1及圖5-1。主要存在的RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、核轉錄因子復合物、細胞-基質黏附連接、線粒體膜間隙、線粒體外膜等細胞組分，見圖5-2。主要執行細胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結合、MAP激酶活性、蛋白磷酸酶結合、趨化因子活性、核激素受體結合、腫瘤壞死因子受體超家族結合等分子功能見圖5-3。

圖5 -3潛在靶基因執行的分子功能（MF）

圖5 -2潛在靶基因所處的細胞組分（CC）

圖5 -1潛在靶基因參與的生物過程（BP）條形圖

KEGG通路富集結果顯示，潛在靶基因主要富集在IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、C型凝集素受體信號通路、Th17細胞分化等信號通路。見附表2。相應的通路富集結果可視化展示見圖6。

圖6 潛在靶基因KEGG通路富集結果條形圖

3 討論

本研究中作用較強的活性分子主要集中在黃酮類化合物，如黃芩苷、柚皮素、山柰酚、川橙皮素、甘草查爾酮A、槲皮素等及植物甾醇類如β-谷甾醇。黃酮類化合物有廣泛的抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調節等藥理活性［11-12］。其中，黃芩苷有顯著的廣譜抗病毒及抗呼吸道炎癥作用，通過影響炎癥信號通路進而抑制多種炎癥因子表達，達到抗炎效果，臨床可用于肺炎、感染等的治療［13-14］。川橙皮素是陳皮中的優效活性分子，具有稀釋痰液、解痙平喘等作用，臨床可用于治療咳嗽痰多等癥［15-16］。氧化應激可導致細胞死亡，其機制包括增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成、線粒體功能障礙、激活凋亡相關死亡信號等。甘草查爾酮A在細胞抗氧化系統中起關鍵作用，可增強細胞本身的抗氧化能力［17］。柚皮素屬二氫黃酮類化合物，能通過NF-κB通路抑制炎癥因子，降低由LPS誘導的肺部炎癥，且能下調TNF-α等因子水平，保護和治療肺損傷［18-19］。山柰酚通過降低MAPK、NF-κB等信號通路，抑制TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β的表達從而發揮抗炎活性［20］，還可通過增加總SOD活力，發揮防治放射性肺損傷的作用［21］。近來研究［22］表明，柚皮素、山柰酚可能通過抑制炎癥反應、調節免疫功能、減輕肺損傷，從而用于COVID-19的治療。姚運秀等［23］研究顯示，槲皮素通過與ACE2結合調節多條信號通路，從而可能用于治療COVID-19。相關分子對接結果提示，槲皮素與2019-nCoV 3CL水解酶有較好的結合活性，且與該病臨床推薦化學藥的親和力相似［24-25］。β-谷甾醇屬植物甾醇的一種，廣泛存在于多種植物的細胞膜，表現出抗炎、抗氧化等藥理活性，其本身無抗病毒活性，但能較好抑制病毒介導的炎癥反應，通過下調RIG-I表達阻斷干擾素合成及干擾素信號轉導，從而抑制放大的免疫應答；抑制病毒誘導CD3+及CD8+T細胞募集至肺組織介導免疫病理，從而發揮抗炎機制［26-27］。

肺內外有害刺激可引發多種炎癥細胞在肺內的募集和活化，釋放大量細胞因子及趨化因子。有害刺激（包括病毒感染）早期，IL-1β與TNF-α迅速分泌，當有害刺激持久強烈或機體免疫亢進時，促炎抗炎平衡被打破，進一步促進如IL-2、IL-6等一系列細胞因子及趨化因子的活化及釋放，引起級聯“瀑布效應”，形成一種失控的炎癥反應，又稱“細胞因子風暴”［28］。“細胞因子風暴”導致自身免疫細胞攻擊正常宿主細胞，造成全身多臟器損傷［29］。COVID-19患者炎癥反應增強，重癥患者血漿中多種促炎因子表達水平更高，整體預后較差，這可能與COVID-19重癥患者發生“細胞因子風暴”的比例更高有關［30-31］。非特異性免疫作為機體對抗流感病毒的第一道防線，在流感病毒入侵呼吸道上皮細胞時啟動，其中最重要的細胞因子為IFN、TNF-α和IL-6［32］。同時，輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）能夠分泌Th2型細胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10等，其中IL-10是Th2中最重要的細胞因子［33］，也是流感后肺炎典型的抗炎細胞因子，流感病毒感染機體時IL-10表達升高，其與肺部炎癥的嚴重程度呈正相關［34］。冠狀病毒感染肺炎時，來源于非特異性免疫或特異性免疫的細胞因子急劇增多，同時趨化因子誘導促炎因子、抗炎因子到達感染部位，導致肺組織廣泛水腫和肺泡表面蛋白失活以及肺毛細血管滲漏，引起急性肺損傷；失控的細胞因子風暴進一步彌散炎癥，肺泡結構破損造成機體肺血氧不足，最終進展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），這可能是COVID-19患者病情加重、死亡的重要原因之一［35-36］。此外，肺泡上皮細胞中的STAT3可被IL-6激活，導致STAT3持續活化和過度表達從而引發肺氣道炎癥［37］。肺炎支原體脂質膜相關蛋白具有活化STAT3的作用，而活化的STAT3能促進黏蛋白分泌［38-39］。研究［40］表明，肺炎支原體感染組中STAT3的表達水平顯著高于對照組，STAT3表達的上調是引發呼吸道相關疾病的因素之一。

在病毒（包括冠狀病毒）感染性疾病中，病毒引發凋亡十分常見。凋亡對于病毒性疾病可能同時存在兩種相反的作用。一方面，機體可以利用凋亡機制殺死被病毒感染的細胞從而有利于清除病毒，另一方面也使病毒顆粒從胞內釋放，反而促進了病毒的傳播。機體在感染SARS、禽流感病毒后的確切致病機理目前尚不明確，但細胞凋亡可能是其中的重要環節［41］。包括SARS、甲型流感病毒性肺炎及其他一些重癥肺炎均有凋亡過程參與［42-44］。而CASP3、MAPK在體內外細胞凋亡方面起關鍵作用［45-46］。首先，Caspase是參與細胞凋亡過程的重要酶類，通過裂解特異性底物調控細胞凋亡。Fas結合蛋白（FADD）結合并激活Caspase-8前體，活化的Caspase-8進一步激活下游死亡執行者Caspase-3，從而誘導細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡中處于凋亡調控的中心位置，而Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡通路中居核心地位，許多Bcl-2家族蛋白都定位于線粒體膜上。當線粒體凋亡通路被激活時，線粒體外膜破壞，線粒體膜間腔的細胞色素C被釋放到細胞質中觸發Caspase級聯反應，引發細胞凋亡。而Bcl-2可以誘導、直接引發或抑制線粒體外膜的通透化，調控細胞凋亡。其次，不同蛋白質激酶分子的逐級序貫磷酸化并激活是細胞信號通路的重要特征。MAPK級聯激活是多種信號通路的中心環節，可將膜受體接受的信號轉導至核內以控制基因表達，是細胞生長、分化和應激反應的共同信號通路［47］。細胞感染SARS病毒后，多條通路的蛋白分子發生磷酸化和去磷酸化改變，尤其p38 MAPK是凋亡中的關鍵一環［48］。

氧化應激（oxidative stress）在多種疾病（包括流感病毒感染）的致炎過程中有重要作用，流感病毒感染引起的肺組織細胞損傷與氧自由基造成氧化應激態升高有關，且氧化應激是造成細胞凋亡的重要因素［49］。氧化應激和脂質過氧化能導致肺臟細胞發生壞死性炎癥及損傷［50-51］，也能調控STAT基因表達，進一步引起細胞因子變化［52］。

KEGG信號通路富集結果顯示，IL-17是一種前炎癥因子，具有促進細胞增殖分化、調節免疫、促進生物因子表達與轉錄作用，氣道出現病毒感染后，CD11b+細胞大量分泌IL-17，IL-17通過結合嗜酸性細胞及氣道上皮細胞表面受體，釋放大量炎性因子，加劇氣道炎癥，加重肺部感染，形成惡性循環［53］。重癥肺炎患者外周血中IL-17顯著升高，且IL-17水平與患者病情發展及嚴重程度密切相關，提示IL-17可能是炎癥反應體系中起重要作用的細胞因子［54］。Toll樣受體（TLR）信號通路亦與肺炎密切相關［55］。TLR是一種模式識別受體，可識別內源性和外源性配體，并通過其信號轉導途徑激活NF-κB誘導前炎癥因子基因轉錄［56-57］。TLR2/3/9介導細胞因子IL-6和IFN-γ的產生和釋放，共同參與宿主對成人病毒性CAP的免 疫 應答［58］。TNF-α是腫瘤壞死因 子（tumor necrosis factor，TNF）的亞型，炎癥時其表達顯著升高，血清含量增多，導致毛細血管通透性升高，炎性滲出增加，并引起免疫反應，從而造成組織細胞受損［59］。研究發現，TNF-α與重癥肺炎發病有密切關系，患者體內TNF-α水平升高的原因主要在于單核-巨噬細胞系統的激活導致單核-巨噬細胞活化增殖增多，從而造成TNF-α分泌增多。冠狀病毒感染機體后TNF-α表達增高，不僅對肺及支氣管造成損傷，還干擾機體免疫調節［60-61］。COVID-19患者大多存在缺氧癥狀，在應對缺氧脅迫過程中，低氧誘導因子1（Hypoxia inducible factor 1，HIF-1）發揮了重要作用，HIF-1主要由HIF-1α及HIF-1β兩個亞單位組成［62］。甲型H1N1流感病毒感染能誘導HIF-1α發生核轉位調控炎性因子表達而加重炎癥反應，炎癥又加重微環境缺氧，導致HIF-1α進一步上調，促進HIF-1α核聚集，這種惡性循環可能是“細胞因子風暴”產生的機制之一，而HIF-1α是整個惡性循環的關鍵節點［63］。研究［64］表明，二陳湯加味可能通過抑制HIF-1α表達與釋放，發揮抗氧化損傷及抗炎作用，從而保護肺組織。

綜上所述，本研究篩選出治療COVID-19的136味中藥，應用網絡藥理學方法對核心中藥進行靶標預測及作用機制分析。CASP3、IL-6、MAPK3、IL-10、IL-1β等可能為中藥治療COVID-19的關鍵靶標，而黃芩苷、β-谷甾醇、槲皮素等活性分子作用較強。核心中藥可能通過作用于IL-17、Toll樣受體、腫瘤壞死因子、低氧誘導因子-1等信號通路，參與調控細胞因子及炎癥免疫介質、細胞凋亡、氧化應激等環節，從而發揮對COVID-19的防治作用。COVID-19傳染性較強，中藥在治療時能發揮多靶點-多環節-整體性優勢。然而由于本研究處方樣本量偏少，對靶標分析深度尚有欠缺，仍待進一步臨床及實驗驗證。

附表1潛在靶基因參與的生物過程（BP）