玉米單倍體誘導加倍技術在實踐中的應用

王 東 鄭 威 馮 曄 王春雷 王 丹 高麗輝 張建華包額爾敦嘎 張 超 金 虎 丁 寧 劉涵淼

（通遼市農業科學研究院 內蒙古通遼028015）

玉米是我國第一大作物，隨著人口的增加和耕地的不斷減少，生產上對高效、優質、抗逆性強的玉米品種的需求日趨迫切，這就要求我們出好品種、快出品種。而常規育種周期較長、選擇效率較低，育成一個玉米新品種需要經歷10 年左右，其中選育優良自交系要經歷5～7 年，這樣很難滿足出好品種、快出品種的要求。單倍體技術、基因工程技術、分子標記輔助育種技術與常規育種技術的有機結合，大大縮短了自交系的選育年限，使常規選系的5～7 年縮短為 1～2 年。

1 單倍體誘導技術

單倍體誘導技術在育種中的應用主要分為兩個階段：一是優良基礎群體材料的誘導階段。本階段根據基礎材料的不同，可以選擇F1代或F2代、F3代進行誘導。誘導時，以基礎材料為母本、優良誘導系為父本進行雜交，秋季挑選胚乳糊粉層紫色胚無色的籽粒為準單倍體備用加倍處理；胚乳糊粉層紫色胚紫色的籽粒和胚乳糊粉層無色胚無色的籽粒均淘汰。二是擬單倍體的加倍過程。準單倍體的加倍方法主要有自然加倍法和人工藥物處理加倍法。由于自然加倍率很低，現在大多數科研單位均采用人工藥物加倍方法，其中采用最多的是秋水仙素加倍處理方法。

秋水仙素是誘導多倍體效果最好的藥劑之一。它的作用機理：當細胞進行分裂時，一方面能使染色體的著絲點延遲分裂，于是已復制的染色體兩條單條分離，而著絲點仍點連在一起，形成“X”形染色體圖像；另一方面是引起分裂中期的紡錘絲斷裂，或抑制紡錘體的形成，結果到分裂后期染色體無微管牽引不能移向兩極，而重組成一個雙倍性細胞核。這時，細胞加大而不分裂，或者分裂成一個無細胞核的子細胞和一個有雙倍性細胞核的子細胞。經過一個時期以后，這種染色體數目加倍了的細胞再分裂增長時，就構成了雙倍性的細胞和組織。

2 秋水仙素加倍流程

2.1 試劑和設備工具的準備

試劑主要包括：Col（秋水仙素）、DMSO（二甲基亞砜）、蒸餾水、酒精、次氯酸鈉；設備工具主要包括人工發芽室、冰箱、通風櫥、防毒面具、手套、量筒、燒杯、帶封閉蓋的大玻璃瓶、大片濾紙、毛巾、托盤、噴壺、刀片、小沙網袋、浸泡桶等。

2.2 種子發芽前處理

首先把準單倍體種子浸泡在溫清水中6 h；其次是在托盤上放置一條沾濕的毛巾，在毛巾上放一層沾濕的濾紙，把浸泡結束的種子胚面向上整齊擺放在濾紙上，再在種子上面蓋一層沾濕的濾紙，然后將毛巾蓋在上面的濾紙上，寫好標簽；最后把裝有準單倍體種子的發芽盤擺放在發芽室 （發芽室溫度控制在28℃左右）精心管理適時適量噴水。

2.3 秋水仙素溶液配制

據研究證明，0.06%的秋水仙素浸泡胚芽加倍效果最佳。將配置秋水仙素溶液所需的Col、DMSO、量筒、燒杯、帶封閉蓋的大玻璃瓶放入通風櫥內，戴上防毒面具和手套等防護措施并打開通風櫥。量取一定體積的蒸餾水加入到大玻璃瓶中，量取總體積5%的DMSO 加入到燒杯中，將Col 粉末加入到燒杯中，待充分溶解后倒入大玻璃瓶中，用蒸餾水定容到所需的Col 溶液體積并封閉用力震蕩5 min 使其充分混合；最后，把配制好的Col 溶液搬放到浸泡室備用。

2.4 準單倍體幼芽胚芽鞘尖端切除

從發芽室取出幼芽長度為2 cm 左右且尖端具有白色小泡的幼苗，根據紫色標記剔除生長勢很強且胚根和膨大胚處為紫色的假單倍體幼苗，通常非單倍體幼苗的根和芽的長度是單倍體的2～3 倍。挑選出真的適合切除的單倍體幼苗，人工切去胚芽鞘尖端2 mm 左右，把不適合切除的幼苗再次放回到發芽室繼續發芽，待幼芽長度達到要求后再進行切芽處理，盡可能的仔細切除后面幼苗的胚芽鞘尖端。

2.5 秋水仙素處理

把切除胚芽鞘尖端的幼苗小心的裝入到小沙網袋中并做好標記，將小沙網袋放入浸泡桶內，戴好防護措施在浸泡室把配制好的Col 溶液倒入到浸泡桶內并密閉浸泡桶，將幼苗浸泡8 h。浸泡結束后取出小紗網袋放入干凈的塑料盒或塑料桶內用流動的清水沖洗30 min 以上，待沖洗結束后取出小紗網袋。

2.6 藥物處理后材料的處理

秋水仙素處理結束后，將幼苗移至育苗室或日光溫室中。在塑料盒底部放置一條濕毛巾，把幼苗從小紗網袋中倒入塑料盒內，均勻鋪開，上面再蓋一條濕毛巾，定期噴灑蒸餾水，也可以給幼苗噴灑一定濃度的生長素，增強苗活力，給它提供良好的高磷培養環境促進根系的發育，待幼苗生根長出新的葉片時及時移栽。

3 田間管理

3.1 幼苗移栽

在幼苗藥物處理之后，田間可以作業，采用大小壟膜下滴灌模式進行栽植。移栽前先覆好膜、滴足水，選擇氣溫不要太高的晴朗天進行移栽，選擇上午6：00開始和下午3：00 以后進行，避免中午高溫對幼苗的傷害。將幼苗按20 cm 的株距進行栽植，幼苗露出地表1～2 cm，封嚴苗口，及時滴水，確保幼苗成活率。

3.2 田間精細管理

幼苗栽植后在田間有一定的緩苗期，這時一定要保證田間濕度。根據氣溫和田間土壤濕潤程度及時澆水，防止幼苗失水而死。田間采用精細管理，及時除草、澆水、施肥、打藥防蟲等。

3.3 田間去除雜株和授粉

單倍體種子在加倍過程中常常不能全株被正常加倍，因此會表現出葉片狹窄且帶有白色條紋、植株矮小、雌穗和葉序活力不夠，在拔節期開始，陸續去除田間生長旺盛、葉片肥大的雜株。在雌穗吐絲前及時給雌穗套小袋，在雄穗散粉期仔細觀察每一個單株的雄穗，看其能否正常散粉，一旦發現雄穗有散粉的情況，立刻授粉并掛牌。

4 注意事項

在準單倍體藥物加倍進程和幼苗田間管理時，有許多需要注意的地方，這些細節有可能導致重大事故或加倍的失敗，經過多年的試驗，主要有以下幾個方面。

4.1 準單倍體發芽期

發芽室的溫度要控制在28℃左右，溫度不能過高也不能過低，否則幼芽會徒長或生長緩慢，影響發芽質量；種子灑水不能太多，以保持毛巾濕潤，水分飽和但托盤中沒有積水為宜；發芽托盤、毛巾、濾紙需提前滅菌處理，以免種子在發芽過程中被感染。

4.2 準單倍體幼芽胚芽鞘切除期

準單倍體幼芽胚芽長度2 cm 為最佳切除時期，切除過早，秋水仙素對其傷害太大，致死率過高；切除過晚，膨大的芽會變成幼葉不能過行切割，也會在裝紗網袋時容易造成斷芽。

4.3 幼芽浸泡時期

由于秋水仙素劇毒，在配制0.06%秋水仙素溶液時，一定要做好防護。保證在穿戴防毒面具的同時盡可能地在通風櫥中操作，如果沒有通風櫥，也要確保在空氣流通順暢的場地進行。配制好的秋水仙素溶液要密封在容器中備用，浸泡桶放入切好的幼芽，倒入配制好的秋水仙素溶液后也要密閉，并且放置在通風效果好的地方。

幼芽浸泡要嚴格控制在8 h，時間過短達不到加倍的效果，時間過長會加重秋水仙素對幼芽的毒害。浸泡后，用流水沖洗時，水量不宜過大，以免造成斷芽，沖洗時間在30 min 以上即可，不可時間過長，以免影響幼芽活性。

4.4 幼芽田間移栽

經過秋水仙素處理的幼芽經過3 d 左右的活性恢復后，選擇陰天或傍晚進行移栽，移栽后立即澆水，以免幼苗失水過多而死。移栽后的幼苗要進行精細管理，由于幼苗栽植只有1～2 cm，根據每天的氣溫和地表土壤干旱程度適時澆水，確保幼苗能夠正常生根生長。

4.5 秋水仙素的保存與處理

根所每年秋水仙素的用量臨時購置，不要一次性購置過多。秋水仙素購置后，檢查密封是否完好，并嚴格的保存在冰箱或冰柜中，不可放置在室溫下或暴露在空氣中；在使用過程中如果秋水仙素不慎沾到皮膚上，必須立即用清水沖洗2 min 以上。用過的秋水仙素溶液不得隨意傾倒，用密封的塑料桶裝好放置在陰涼的角落，并做好標記，放置1 年以上待失去藥性后方可傾倒。