SPG20甲基化和EGFR表達在肺腺癌中相關性及臨床意義

趙寶山 孫光蕊 張志民 張 旭 辛國華 梁宗英

全世界范圍內原發肺腺癌的發生率逐年遞增，已超過鱗癌成為肺癌的最常見病理類型[1]。醫學技術的進步使得肺癌患者的整體生存率雖有所提高，但仍然很低[2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是目前公認的與肺腺癌發生、發展關系最為密切的基因之一。EGFR能啟動細胞內異常信號轉導導致腫瘤的產生，并使腫瘤細胞增殖、分化、遷移凋亡等功能發生明顯變化[3,4]。表觀遺傳學中的甲基化修飾在惡性腫瘤的發生與發展過程中起到十分關鍵的作用，異常甲基化修飾會導致基因轉錄、翻譯的功能改變，進而導致癌癥的發生。最新研究發現，SPG20基因異常甲基化與結直腸癌、肝癌和胃癌之間存在密切關系，并作為早期事件[5,6]。本研究通過檢測肺腺癌組織內SPG20甲基化及EGFR水平，探討二者在肺腺癌發生過程中的相關性，以期為肺腺癌的病理生理機制研究和臨床治療提供理論依據。

資料與方法

1.標本:選取2019年1月～2020年10月承德醫學院附屬醫院胸外科原發肺腺癌手術患者70例；術前均未進行任何治療。實驗組為腺癌組織，對照組為正常肺組織(距癌組織邊緣>6cm)。其中男性17例，女性53例；≥60歲27例，<60歲43例；吸煙患者12例，不吸煙患者58例；按照IASLC第8版制定的標準進行TNM分期：Ⅰ期37例，Ⅱ期26例，Ⅲ期7例；組織學分級：高分化8例，中分化57例，低分化5例；有淋巴結轉移7例，無淋巴結轉移63例。本研究經過筆者醫院醫學倫理學委員會批準通過。

2.主要試劑：甲基化試劑盒購自德國Qiagen公司；焦磷酸測序試劑購自美國CST公司；DNA提取試劑盒購自北京全式金生物有限公司；EGFR抗體購自英國Abcam公司。甲基化引物(華大基因合成)：上游引物：5′-AGGAAGTATGAAAGAATGTATTGTAAAG-3′；下游引物：5′-CCCCTCAAAATTAAACAACCTTTCTCTACA-3′。

3.實驗方法：(1)焦磷酸測序法檢測法檢測甲基化：提取DNA，以重亞硫酸鹽轉化試劑盒對DNA進行亞硫酸鹽修飾。低溫保存備用。甲基化的反應條件為：95℃預變性3min，94℃變性30s，50℃退火，72℃延伸1min，40個循環，最后一個循環72℃延伸7min。應用Pyrose Quencing軟件分析甲基化狀態。4個CpG位點甲基化改變平均值作為甲基化結果，以遠癌正常肺組織作為實驗對照組。(2)免疫組織化學(SP)：石蠟組織切片脫蠟。3%甲醇-H2O2溶液及枸櫞酸鈉緩沖液加熱處理組織切片。非免疫山羊血清封閉，加一抗，孵育60min，加入二抗；PBS處理后，加入鏈親和素-過氧化物酶工作液；DAB顯色，蘇木精復染，樹膠封片固定。(3)免疫組化判斷標準：根據細胞膜、胞質染色程度和著色陽性細胞所占百分率進行評價計分(每張切片高倍鏡下隨機觀察10個視野)；染色強度評分標準(A)：無色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)。著色陽性細胞所占百分率評分標準(B)：1分(陽性細胞≤10%)，2分(陽性細胞>10%～50%)，3分(陽性細胞>50%～75%)，4分(陽性細胞>75%)。以A+B所得分數作為評判標準：0～2分為陰性，3～-4分為陽性，5～7分為強陽性。(4)Western blot法檢測蛋白表達：提取蛋白，測定濃度；常規制備電泳蛋白上樣液，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，4℃，90V 60～80min轉膜。加一抗4℃過夜。次日孵育二抗，重復洗膜3次。

結 果

1.SPG20甲基化水平：詳見表1。

表1 SPG20在腺癌組織和正常肺組織中的甲基化水平

2.EGFR、SPG20蛋白表達水平(SP法)：在腺癌組織中EGFR基因陽性表達為72.86%，顯著高于正常肺組織的表達(18.57%)，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)；SPG20在腺癌組織中陽性率為31.43%，低于正常肺組織(77.14%)，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖1和表2。

表2 EGFR和SPG20在腺癌組織和正常肺組織中的表達水平

圖1 EGFR和SPG20在腺癌組織及正常肺組織中的表達(HE，×200)A.EGFR腺癌組織中陽性；B.EGFR正常肺組織中陰性;C.SPG20腺癌組織中陰性;D.SPG20正常肺組織中陽性

3.EGFR、SPG20蛋白表達水平(Western blot法)：EGFR在腺癌組織中表達為76.38%±2.67%，高于正常肺組織23.14%±1.86%(圖2)；SPG20在腺癌組織中表達為18.42%±1.34%，高于正常肺組織65.75%±2.47%，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見圖3。

圖2 EGFR在腺癌組織及正常肺組織中表達水平與腺癌組織比較，*P<0.05

圖3 SPG20在腺癌組織及正常肺組織中表達水平與腺癌組織比較，*P<0.05

4.SPG20甲基化與EGFR相關性:SPG20甲基化和EGFR表達相關系數為r=1.00，χ2=6.37 (P<0.05),二者具有相關性，詳見表3。

表3 在腺癌組織中SPG20甲基化與EGFR表達相關性(n)

5.肺腺癌組織SPG20甲基化、EGFR與臨床病例特點的相關性：SPG20甲基化及EGFR均與肺腺癌TNM分期、組織分化程度及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)；與患者性別、年齡和吸煙與否無相關性，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表4。

表4 SPG20甲基化和EGFR與臨床病例特點的相關性

討 論

肺腺癌是肺癌的常見病理類型，其發生率逐年遞增，已成為肺癌最常見的病理類型，且發病年齡的年輕化趨勢愈加明顯[7,8]。現代醫學研究發現肺癌的發生和發展是涉及多個基因、多個階段、多個因素共同作用的結果[9]。目前肺腺癌的基因靶向治療雖取得了一定的進展，但肺腺癌患者預后仍有待進一步提高。因此，提高肺腺癌早期診斷率、發現評估預后新指標和抗腫瘤治療的新靶點至關重要[10,11]。

表觀遺傳學中甲基化修飾是惡性腫瘤發生機制之一，參與多種人體腫瘤的發生和發展[12]。研究證實,DNA甲基化修飾的紊亂狀態會導致基因表達異常而導致細胞的惡性轉化最終發生腫瘤[13]。DNA甲基化在腫瘤中作用主要表現在以下幾個方面：(1)甲基化造成基因突變[14]。(2)甲基化夠阻止基因轉錄，導致抑癌基因低表達甚至不表達，促進腫瘤的發生、發展和轉移[15]。(3)癌基因甲基化水平降低而活化癌基因導致腫瘤的發生、發展和轉移[16]。(4)基因組的低甲基化和部分癌基因啟動子低甲基化而導致腫瘤惡性程度的增加。研究發現，基因的甲基化狀態與腫瘤組織分型、分級和病理分期密切相關,是腫瘤早期診斷和患者預后的一個重要指標[17]。本研究結果顯示，腫瘤相關因子SPG20在肺腺癌組織中發生了甲基化，且呈高甲基化狀態。統計學分析結果顯示，SPG20高甲基化狀態與肺腺癌TNM分期、組織分化程度和淋巴結轉移密切相關。研究結果提示，SPG20的甲基化可能參與了肺腺癌的發生，并促進了其進一步的發展。

SPG20基因編碼Spartin多功能蛋白，參與人體多種疾病包括腫瘤的發生。研究表明，SPG20基因發生甲基化會造成基因表達抑制或缺失，進而導致Spartin蛋白減少或缺失。SPG20在細胞分裂周期的異常作用與腫瘤的發生具有相關性。更有研究表明，SPG20與EGFR的降解有關，影響該受體的胞吞及運輸作用。SPG20啟動子甲基化在卵巢癌中的作用已經被證實，并提出作為前列腺癌的全基因組甲基化分析目標[18]。在乳腺癌、前列腺癌及肝癌中通過外源性干預甲基干預某些關鍵癌基因DNA，實現了抑制這些癌基因的過表達,進而抑制該腫瘤的增殖、侵襲和轉移[19～21]。本研究顯示，在肺腺癌組織中SPG20的蛋白表達明顯低于正常肺組織，筆者分析，SPG20在癌組織中的低表達可能是因為肺腺癌組織中SPG20的高甲基化狀態抑制了SPG20的基因轉錄，使其在組織中表達下降，進而促進了肺腺癌的發生。

表皮生長因子受體EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產物，在細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。EGFR突變造成其功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性異常會引起腫瘤的發生。研究表明，EGFR與人體內多種實體腫瘤的血管生成、侵襲及轉移密切相關。本研究免疫組化檢測肺腺癌中EGFR的結果顯示，EGFR在癌組織中陽性表達明顯高于癌旁組織，進一步通過蛋白免疫印跡方法定量檢測EGFR表達量。EGFR在癌組織中高表達，與正常組織表達量存在明顯差異，說明肺腺癌的發生與EGFR之間存在密切的相關性。

通過分析EGFR與肺腺癌患者臨床病例特征的相關性結果顯示，EGFR的表達水平與肺腺癌TNM分期、組織分化程度及淋巴結轉移密切相關；SPG20甲基化和EGFR的相關性分析結果顯示，癌組織中SPG20高甲基化組織中EGFR亦高表達，二者呈正相關。筆者分析，SPG20作為“抑癌因子”在肺腺癌組織內發生了甲基化，使其基因表達受到抑制，進而可能促進了作為“促癌因子”的EGFR在癌組織中的高表達，最終促進了肺腺癌的惡性程度增強,導致其容易通過淋巴結發生轉移，降低了患者的生存率。

基于上述理論及研究結果，SPG20甲基化及EGFR與肺腺癌發生、發展、侵襲、轉移及預后密切相關，但其具體作用機制尚不明確。今后研究中將以SPG20甲基化為切入點，結合EGFR研究為重點,對其促癌機制進行深入研究。對DNA異常甲基化的研究可以更加深入地了解到惡性腫瘤的發病機制,為今后早期診治、預后判斷等提供更為可靠的依據。