心室減負荷對缺血性心力衰竭MMPs/TIMPs的影響

劉永輝 孟嘉天 孟自力 李 強 鄭 浩 王浩東 邸紅芹

心臟輔助裝置特別是左心輔助裝置(LVAD)除了作為心臟移植的“橋梁”外，還可作為治療終未期心臟病的最終手段，但是其機制還沒有完全清楚，而且，LVAD 對缺血性心肌病來說，遠較其他病因的心臟病的療效差[1,2]。

心室重塑被認為是各種病因導致晚期心臟功能衰竭共同的發病機制， 而與心室重塑的調控最為密切是基質金屬蛋白酶(matrix metallopmteinases，MMPs)及其抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)，兩者均是調控細胞外基質代謝的重要酶類，它們之間的協調平衡在心肌塑形、血管塑形、血管形成等方面起著重要作用，與心力衰竭心臟的疾病發展過程密切相關[3,4]。本研究選用缺血性心肌病模型來進行減負荷，以探討減負荷對心室重塑中MMPs-TIMPs 軸的影響。

材料與方法

1.實驗動物：本實驗所使用的動物均為成年雄性同系lewis大鼠，首次手術前體質量180g～220g，由北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供。所有術前、術后實驗動物均在筆者醫院實驗動物中心飼養。所有與實驗動物相關的處理均符合《北京市實驗動物管理條例》(1996年10月)。所有的動物實驗均得到動物委員會的批準。

2.實驗試劑及配方：異氟醚吸入麻醉劑購自美國百特(Baxter)公司，溴化乙錠(EB)購自美國Sigma公司，利多卡因(100毫克/支)國產，嗎啡注射液，國產，10mg/1ml，溶于10ml 0.9%NaCl注射液備用。注射用長效青霉素(120萬單位/支)購自墨西哥Lakinter公司。4%多聚甲醛：A液(8%多聚甲醛)以多聚甲醛干粉加蒸餾水配制，56℃水浴加溫同時加入適量1mol/L的NaOH促進多聚甲醛溶解；B液(0.2mol/L PBS)每1000ml中溶解有NaH2PO45.928g，Na2HPO457.996g及NaCl 2g。A液和B液等比例混合即可，保存于4℃冰箱備用。

3.大鼠心肌梗死模型的制備：使用50ml針筒作為呼吸面罩連接683型小動物呼吸機，以氧氣和異氟醚的混合氣體3L/min進行維持吸入麻醉[5,6]。麻醉成功后大鼠右側臥位，連接心電監測，消毒鋪巾。經第5肋骨間逐層入胸。以左心耳下緣平齊位置為定位標記，用7-0滑線試結扎前降支，以心臟前壁局部顏色轉為蒼白為標準。結扎后可見心電示波有心肌梗死表現，大部分情況下出現室性心律失常。當左心室前壁部分顏色轉為蒼白且出現心電示波為心肌梗死時才能確認本模型制作成功。7×17絲線逐層關胸。

4.心力衰竭模型的制備及實驗分組[5,6]：將形成24 只缺血性心肌病心力衰竭模型動物，隨機分為兩組，即減負荷組(n=14)與心力衰竭組 (n=10)，前者通過異位心臟移植的方法，形成左心室減負荷模型；后者不進行心臟移植。空白對照組(n=8)，大鼠接受開胸手術，但是不結扎冠狀動脈。2周后，移植后的心力衰竭心臟、未移植的心力衰竭心臟、及正常心臟分別進行取材進行分析。

5.心功能的檢測[7]：用心臟超聲檢測心力衰竭模型的心臟功能，用Langendoff模型測定心臟減負荷后的心臟功能，使用Powerlab配套軟件(chart 4.0 for windows)計算每個測定點收縮末壓力、舒張末壓力、收縮末dp/dt、舒張末dp/dt以及發展壓[7]。

6.TMPs 及TIMPs 的基因表達：從心臟組織提取總RNA，通過反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)，將mRNA反轉錄形成cDNA,即取2μg總RNA 在MMLV反轉錄酶(Promega)、Oligo(dT)15 37℃下孵育 1h，形成cDNA[3,8]。用5μl cDNA 在Tag DNA多聚酶下行PCR。GAPDH作內對照，檢測MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9以及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3。每個PCR產物用10μl進行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外透照燈進行相應的分析[9,10]。

7.Western blot 法檢測分析：取適量冰凍樣品，置入細胞裂解液、勻漿、離心后，取上清液行濃度測定[8,11]。用抗 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9 的抗體，作為一抗，用辣根過氧化物酶標記的相應抗體作為二抗，EB染色，拍照，密度掃描。計算出待測基因表達量與相應GADPH表達量的比值。

結 果

1.3組大鼠心臟功能變化：從心臟超聲結果(圖1A)可見， 與對照組比較，移植前心力衰竭組與減負荷組的FS及EF有明顯下降，差異有統計學意義(P=0.000)，但是，心力衰竭組與減負荷組FS及EF比較，差異無統計學意義。Langendorff模型心功能評價(圖1C)顯示，減負荷2周后可以改善心臟功能。與心力衰竭組比較，減負荷組的左心室發展壓有明顯的升高，左心室發展壓在左心室球囊容積為0.04ml時,差異有統計學意義(P=0.007)。

圖1 3 組大鼠減負荷前后心功能的改變A.3組大鼠減負荷前射血分數的變化；B.3組大鼠減負荷前短軸縮短率的變化；C.3組大鼠Langendorff 檢測的變化。與對照組比較，*P<0.01;Δ1mmHg=0.133kPa

2.3組大鼠MMPs 的表達：與對照組比較，心力衰竭組中的MMP-1、MMP-2和MMP-9 基因表達明顯增加，差異有統計學意義，其中以 MMP-2 的上升更為明顯。與心力衰竭組比較，在減負荷后，減負荷組的 MMP-2和MMP-9基因表達水平下降明顯，差異有統計學意義。心力衰竭組與減負荷組MMP-7的基因表達水平比較，差異無統計學意義，詳見圖2。

圖2 3組大鼠MMPs 的不同基因表達水平A.3組大鼠MMPs 的數據表達；B.3組大鼠MMPs 的基因變化。與心力衰竭組比較， *P<0.05,**P<0.01；與對照組比較，#P<0.05, ##P<0.01

3.3組大鼠TIMPs的表達：左心室減負荷改變了心力衰竭心臟的TIMP基因的表達 (圖3)。與心力衰竭組比較，減負荷后的TIMP-2 和 TIMP-3 的基因表達明顯升高,差異有統計學意義，其中TIMP-3升高更為明顯，幾乎達到正常水平。TIMP-1的升高雖然沒有達到統計學意義，但也有所升高。

圖3 3組大鼠TIMPs不同基因在減負荷2周后的表達水平A.3組大鼠TIMPs 的數據表達；B.3組大鼠TIMPs 的基因變化。與心力衰竭組比較，*P<0.05, **P<0.01

4.3組大鼠TIMPs/MMPs的比值：減負荷后 TIMPs/MMPs的比值也有所升高 (圖4)。與心力衰竭組比較，TIMP-1/MMP-1的比值和 TIMP-3/MMP-9 均有明顯升高 (P<0.05)； TIMP-2/MMP-2的比值升高更為明顯 (P<0.01)。

圖4 3組大鼠TIMPs/MMPs 基因表達的比值在減負荷2周后的表達水平A.3組大鼠TIMP1/MMP1的變化；B.3組大鼠TIMP2/MMP2的變化；C.3組大鼠TIMP3/MMP9的變化。與心力衰竭組比較，TIMP-1/MMP-1的比值和 TIMP-3/MMP-9 均有明顯升高 (P<0.05)；TIMP-2/MMP-2 的比值升高更為明顯(P<0.01);與心力衰竭組比較，*P<0.05, **P<0.01

討 論

MMPs及TIMPs出現在心臟、血管等組織中，MMPs及TIMPs之間比例失衡導致正常纖維膠原降解增加及進行性心室擴張，從而影響細胞外基質的塑形，在心力衰竭的心室重構中發揮重要作用，因此，調節MMPs、TIMPs的活性及比例為限制心室重構和預防心力衰竭提供了一個重要的治療手段[8,12,13]。

本研究通過對大鼠缺血性心力衰竭心臟進行移植構建減負荷模型，利用該模型來進行MMPs-TIMPs 軸的分析。在減負荷2周后，心力衰竭心臟MMP-1、 MMP-2和MMP-9的表達下降，TIMP-2和TIMP-3上升， TIMP-3/MMP-9、TIMP-1/MMP-1和TIMP-2/MMP-2三者之比均顯著增高(尤其TIMP-2/MMP-2之比增高更為明顯)，而 TIMP-1和MMP-7 的增高不明顯。因此， 在判斷心肌基質穩態方面，TIMPs與 MMPs之比值較單個MMPs或TIMPs 更敏感， TIMPs與 MMPs之比值更能反映基質的降解與修復的穩態，這一點與臨床中患者的心力衰竭心臟的表達水平相似[14]。由于左心輔助的減負荷作用，使心力衰竭的心臟的TIMP-3與 MMP-9 之間不平衡得到恢復，從而產生了逆向重塑，使心臟功能得到恢復[1,13,15,16]。Kasten等[17]在擴張型心肌病心力衰竭的研究中發現，心臟減負荷后可以使心力衰竭后上升的MMP-1、MMP-9下降，TIMP-1 上升，從而維持 MMP-1/TIMP-1 比值的穩定。Klotz等[18]在另一擴張型心肌病的實驗中發現，由于TIMP-3與 MMP-9 之間的不平衡，直接導致了細胞間質的降解加重，從而引起了擴張型心肌病。

在某些心肌病的實驗顯示，MMPs的抑制劑可抑制心室塑型、改善心臟功能，這提示降低MMP的活性，其利大于弊[12,13,19]。TIMP-3與MMP-9的比例不協調通過加速基質的降解而引起擴張型心肌病，反之，在臨床上，由于機械減負荷，使TIMP-3與MMP-9的比例協調，調節了細胞外基質穩態及組織塑型，從而減輕心室重構[10,12,20]。本研究中減負荷2周后，VAD支持后心臟的MMPs和TIMPs保持較好的穩態，其可能機制是減輕了心臟組織的張力，減少了細胞滲出，減輕了炎性因子的剌激反應，缺血剌激了MMPs的產生，抑制了TIMP-1， MMPs 的降低及TIMPs的升高，可使正常心臟組織的破壞減輕。因此，VAD支持后心臟可以逆轉MMPs和TIMPs 的比例，并增加心臟冠注。因此，筆者認為，減負荷改善心室重構的機制在于，其可能通過調節TIMP-MMPs之間旁分泌的機制，促進基質重構。

綜上所述，本實驗的心力衰竭后減負荷模型可以模擬臨床上心力衰竭患者進行VAD情況。通過研究證實，MMPs-TIMPs軸在心力衰竭后減負荷中有一定的作用，減負荷可以顯著降低心臟的MMP-1、MMP-2和MMP-9水平，升高TIMP-1和TIMP-3水平，從而使TIMPs-MMPs之比增高，其中，與單一的MMPs 或 TIMPs水平比較，TIMPs-MMPs對評估心肌的基質穩態更加敏感。