LINC00598靶向調控miR-381-3p影響宮頸癌細胞生物學行為的機制研究

蔡 晶 巫夢雪 張 婷 王 琳

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，其發生率及病死率較高，且發病年齡有年輕化趨勢[1]。腫瘤細胞的生長和轉移是宮頸癌患者死亡的主要原因[2]。目前，手術治療、化療、免疫治療、放療等是其主要治療手段，然而部分患者的預后較差[3]。宮頸癌的發病機制并未完全闡明，探究宮頸癌進展的分子機制可能對其臨床治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度不少于200個核苷酸的內源性RNA分子，其在不同腫瘤中的表達趨勢差異顯著，lncRNA通過參與調節腫瘤細胞內的生物學過程，影響腫瘤的發生和進展[4, 5]。

LINC00598在乳腺癌、結直腸癌、肝癌等腫瘤細胞系中高表達，可促進腫瘤細胞的增殖[6]。LINC00598在宮頸癌發展和轉移中的作用機制并不清楚。本研究通過DIANA數據庫預測發現LINC00598與miR-381-3p存在靶向序列。Shang等[7]研究表明，miR-381-3p通過直接靶向成纖維細胞生長因子7(fibroblast growth factor 7，FGF7)抑制宮頸癌進展。本研究旨在檢測LINC00598在宮頸癌細胞系中的表達，通過在宮頸癌細胞系中沉默LINC00598表達，驗證LINC00598對miR-381-3p表達的調控作用及對宮頸癌細胞增殖和侵襲的影響。

材料與方法

1.細胞與試劑:宮頸癌細胞C33A、HeLa、SiHa、HCC94及人正常宮頸上皮細胞H8購自美國標準培養物保藏中心。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司。胎牛血清、DMEM/F12培養基、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶購自美國Amresco公司。無意義陰性序列、LINC00598小分子干擾RNA(siRNA:GGAUGUCUACAUAGAUUUAGA)、熒光素酶報告載體(LINC00598野生型載體、LINC00598突變型載體)、miR-381-3p模擬物、miRNA陰性對照購自上海吉瑪生物制藥有限公司。qRT-PCR試劑盒、反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。MTT試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。Matrigel基質膠、Transwell小室購自美國Corning公司。一抗FGF7、β-tubulin、RAS、p-ERK1、myc-1及山羊抗兔二抗均購自美國CST公司。

2.細胞轉染及分組:HeLa、SiHa、HCC94細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，C33A、H8細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37℃、體積分數5%CO2培養箱內培養。收集對數生長期HeLa細胞接種于24孔板，HeLa細胞生長融合至40%時，隨機分為對照組(轉染無意義陰性序列)和siRNA組(轉染LINC00598小分子干擾RNA)，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。48h后，收集對數生長期HeLa細胞進行功能實驗。

3. qRT-PCR檢測LINC00598、miR-381-3p和FGF7 mRNA相對表達:利用TRIzol法提取細胞總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書合成為cDNA。配置qRT-PCR反應體系，LINC00598和FGF7 mRNA以GAPDH為內參，miR-381-3p以U6為內參。LINC00598上游引物為5′-GGGGGAAAACATGCA-GAAT-3′，下游引物為5′-TTCACACTCTGAG-AAGACAAGGAC-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTC-ACGAATTTGCGT-3′；miR-381-3p上游引物為5′-TACTTAAAGCGAGGTTGCCCTT-3′，下游引物為5′-GGCAAGCTCTCTGTGAGTA-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；FGF7上游引物為5′-GCAACTGAACTTACTACGAACT-3′，下游引物為5′-ATTGACCTCTTCCTATCTGTGA-3′。采用2-ΔΔCt法計算LINC00598、miR-381-3p和FGF7 mRNA相對表達。

4.雙熒光素酶報告基因檢測驗證LINC00598的靶基因:運用DIANA數據庫預測LINC00598的靶基因為miR-381-3p。將熒光素酶報告載體(LINC00598野生型載體、LINC00598突變型載體)分別與miR-381-3p、miRNA陰性對照共轉染至宮頸癌HeLa細胞，轉染48h后收集細胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測每組HeLa細胞的相對熒光素酶活性。

5.Western blot法檢測FGF7蛋白和RAS/ERK信號通路蛋白蛋白表達:收集各組宮頸癌HeLa細胞，采用蛋白裂解液提取總蛋白，蛋白煮沸變性，每組取50μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，分離后的蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜，在7%脫脂牛奶中封閉。稀釋一抗FGF7(1∶2000稀釋)、β-tubulin(1∶2000稀釋)、RAS(1∶2000稀釋)、p-ERK1(1∶2000)、myc-1(1∶2000)，4℃搖床孵育10h。稀釋二抗(1∶5000稀釋)，搖床孵育2h。配置電化學發光液，采用凝膠成像系統曝光和顯影。

6.MTT法檢測HeLa細胞增殖:收集各組宮頸癌HeLa細胞，消化為單細胞懸液，以200微升/孔細胞接種于96孔板。分別于第1、2、3、4、5天，向每孔加入5mg/ml的MTT試劑20μl。培養箱中孵育4h，吸去上清，加入140μl二甲基亞砜，震蕩15min，用全自動酶標儀檢測波長450nm處各孔的吸光度(A)值，繪制HeLa細胞生長曲線。

7.Transwell實驗檢測HeLa細胞侵襲:采用預冷的培養基按照8∶1的比例稀釋Matrigel膠，在Transwell小室上室加入30μl稀釋液，培養箱內孵育3h。收集各組宮頸癌HeLa細胞，用不含胎牛血清的培養基稀釋成單細胞懸液，以200微升/孔加入Transwell小室上室，下室加入含胎牛血清的培養基600μl。培養箱內培養24h，采用多聚甲醛溶液固定40min，采用0.2%結晶紫溶液染色40min，棉簽擦去未侵襲的HeLa細胞，在100倍倒置顯微鏡下計數侵襲細胞數。

結 果

1. LINC00598與宮頸癌患者總生存期的關系:GEPIA在線數據庫顯示(圖1)，LINC00598低表達的宮頸癌患者總生存期明顯長于LINC00598高表達的患者，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 LINC00598與宮頸癌患者總生存期的關系

2.LINC00598在宮頸癌細胞系中低表達:qRT-PCR檢測結果顯示(圖2)，LINC00598在宮頸癌細胞(C33A、HeLa、SiHa、HCC94)及正常宮頸上皮細胞H8的表達分別為4.96±0.28、7.36±0.46、2.41±0.51、4.30±0.50和1.05±0.10。與H8細胞比較，宮頸癌細胞系中LINC00598表達顯著升高(P<0.05)，其中LINC00598表達最高的細胞系是HeLa(P<0.01)。

圖2 LINC00598在宮頸癌細胞系和正常宮頸上皮細胞中的表達與H8細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉染LINC00598小分子干擾RNA抑制HeLa細胞中LINC00598表達:轉染LINC00598小分子干擾RNA后，siRNA組和對照組HeLa細胞中LINC00598表達分別為0.27±0.04和1.05±0.19，提示轉染成功(P<0.01)。

4.生物信息學軟件預測LINC00598的靶基因:DIANA數據庫預測顯示(圖3)，LINC00598與miR-381-3p存在靶向序列。

圖3 DIANA數據庫預測LINC00598的靶基因

5.雙熒光素酶報告基因檢測驗證LINC00598對miR-381-3p的靶向作用:雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示(圖4)，在轉染LINC00598野生型載體實驗中，miR-381-3p組相對熒光素酶活性顯著低于miRNA陰性對照組(P<0.01)。

圖4 雙熒光素酶報告基因法驗證LINC00598對miR-381-3p的靶向作用與miRNA陰性對照組比較，*P<0.01

6.沉默LINC00598對miR-381-3p和FGF7 mRNA表達的影響:qRT-PCR檢測結果顯示，siRNA組和對照組HeLa細胞中miR-381-3p表達分別為6.74±1.49和1.01±0.22，差異有統計學意義(P<0.01)。siRNA組和對照組HeLa細胞中FGF7 mRNA表達分別為0.28±0.07和0.98±0.09，差異有統計學意義(P<0.01)。

7.沉默LINC00598對FGF7蛋白和RAS/ERK信號通路蛋白表達的影響:Western blot法檢測結果顯示(圖5)，沉默LINC00598表達后，FGF7蛋白表達降低，RAS/ERK信號通路蛋白RAS、p-ERK1、myc-1表達增加，間質細胞表型蛋白Twist表達降低。

圖5 沉默LINC00598對HeLa細胞FGF7蛋白和RAS/ERK信號通路蛋白表達的影響

8.沉默LINC00598對HeLa細胞增殖活力的影響:MTT法結果顯示(圖6)，在第2、3、4、5天，siRNA組HeLa細胞A值明顯低于對照組(P<0.05)。

圖6 沉默LINC00598對HeLa細胞增殖活力的影響與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

9.沉默LINC00598對HeLa細胞侵襲能力的影響:Transwell實驗結果顯示，siRNA組和對照組HeLa細胞的穿膠細胞數分別為95.47±13.18個和192.14±18.72個，差異有統計學意義(P<0.01，圖7)。

圖7 沉默LINC00598對HeLa細胞侵襲能力的影響A.Transwell實驗穿膠細胞(結晶紫染色，×100)；B.Transwell實驗定量結果

討 論

既往研究表明，部分lncRNA如LINC00116、MIAT、FTH1P3、PVT1在宮頸癌組織中異常高表達，通過調控抑癌基因的失活，增強宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力，促進宮頸癌的惡性進展[8～11]。部分lnRNA如PTENP1、HAND2-AS1、UBE2R2-AS1、PTCSC3在宮頸癌組織中異常低表達，通過抑制癌基因的激活，降低細胞增殖活性，促進宮頸癌細胞凋亡[12～15]。因而，積極研究lncRNA在宮頸癌發生和發展過程中的作用機制，對改善宮頸癌臨床治療效果具有重要意義。Ghatnatti等[16]研究表明，LINC00598在垂體泌乳素瘤中高表達，其可能成為垂體泌乳素瘤發病機制的新型生物學標志物。Jeong等[6]研究表明，LINC00598在多種腫瘤細胞系中高表達，其可通過促進細胞周期蛋白2轉錄的穩定性，促進腫瘤細胞的增殖。本研究通過GEPIA在線數據庫分析顯示，LINC00598低表達的宮頸癌患者總生存期明顯長于LINC00598高表達的患者，LINC00598低表達與患者生存期存在相關性。同時，本研究結果顯示不同宮頸癌細胞系中LINC00598表達均明顯增加，提示LINC00598在宮頸癌發生過程可能起到關鍵作用。細胞實驗結果進一步顯示，沉默LINC00598表達可抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖和侵襲能力，提示LINC00598能夠抑制宮頸癌進展。

lnRNA主要通過與miRNA的相互作用，抑制miRNA對下游靶基因表達的干擾，參與宮頸癌的進程[17]。本研究通過DIANA數據庫預測顯示，LINC00598與miR-381-3p存在結合位點。同時，雙熒光素酶報告基因實驗證實LINC00598可靶向調控miR-381-3p表達。miR-381-3p在頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤等腫瘤中低表達，發揮抑癌作用[18,19]。miR-381-3p在宮頸癌組織和細胞系中呈低表達，miR-381-3p通過抑制靶基因FGF7表達，抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲，促進宮頸癌細胞的凋亡[7]。本研究結果顯示，沉默LINC00598表達后，宮頸癌HeLa細胞中miR-381-3p表達顯著增加，說明沉默LINC00598通過上調miR-381-3p表達改善宮頸癌細胞的惡性生物學行為。本研究結果顯示，沉默LINC00598表達可顯著促進宮頸癌HeLa細胞中FGF7基因的表達，進一步證明LINC00598通過調節miR-381-3p表達發揮作用。RAS/ERK信號通路在宮頸癌細胞中激活，促進宮頸癌的發生和發展[20]。FGF7基因表達降低后，RAS/ERK信號通路激活受到抑制。

綜上所述，LINC00598在宮頸癌細胞系中高表達，沉默LINC00598表達可靶向上調miR-381-3p表達并且下調FGF7基因表達，抑制RAS/ERK信號通路激活，進而影響宮頸癌HeLa細胞的增殖及侵襲過程。LINC00598有望成為宮頸癌診斷和治療的分子靶點。