高糖環(huán)境下cGAS-STING通路在巨噬細胞活化中的作用

韓 雪 韓東宛 刁宗禮 黃紅東 劉文虎

研究表明，糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是一種慢性免疫炎性疾病，巨噬細胞活化在DN炎性過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[1]。巨噬細胞浸潤、細胞信號及細胞因子共同參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。

干擾素基因激活蛋白(stimulator of interferon genes，STING)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)能夠激活STING，cGAS-STING信號通路可通過調(diào)控多種細胞信號表達引發(fā)固有免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)，是多種慢性免疫炎性疾病的潛在發(fā)病機制[3～5]。目前該信號通路在DN中的作用尚不清楚。

本研究在人體及細胞水平觀察高糖環(huán)境下，巨噬細胞cGAS-STING信號通路的表達情況，并明確該通路對巨噬細胞活化的影響，初步探討cGAS-STING信號通路在DN慢性炎性反應(yīng)過程中可能的生物學(xué)功能。

材料與方法

1.主要材料：小鼠單核-吞噬細胞系RAW264.7購自美國ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基等購自美國Gibco公司；cGAS抗體、STING抗體、p65 NF-κB及p-p65 NF-κB等抗體購自美國CST公司；CD11b、F4/80、CD86、CD206等流式抗體購自美國Biolegend公司；STING抑制劑C-176購自美國MCE公司；引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

2.免疫組織化學(xué)實驗：以瘤旁正常腎組織為對照，檢測DN患者腎組織M1型巨噬細胞標(biāo)志物CD86及STING的表達。石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗、對組織進行抗原修復(fù)；加用非特異染色阻斷劑室溫孵育10min；除去阻斷劑后加入一抗室溫孵育60min；加入二抗室溫孵育10min；DAB染色液顯色、核固紅復(fù)染、封片。

3.免疫熒光雙染實驗：以瘤旁正常腎組織為對照，檢測DN患者腎組織M1型巨噬細胞標(biāo)志物CD86及STING的表達。石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗、對組織進行抗原修復(fù)；0.5%Triton X-100室溫下通透20min，5%BSA室溫封閉30min；加入STING一抗4℃孵育過夜；加入二抗室溫孵育60min，5%BSA室溫封閉30min；加入CD86一抗4℃孵育過夜；再加入二抗室溫孵育60min；沖洗、封片、4℃保存。

4.細胞培養(yǎng)及分組：細胞以4×104個/毫升的濃度接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%融合狀態(tài)時，0.25%胰蛋白酶消化進行傳代。細胞分組：①正常對照組(NG組)：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5.5mmol/L；②高糖組(HG組)：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為30mmol/L;③HG+C-176組：STING抑制劑C-176的濃度為1μmol/L；④NG+C-176 組: C-176濃度為1μmol/L。

5.Western blot法檢測：胰酶消化細胞，向細胞沉淀中加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液(二者比例為1∶100)，BCA法測定樣本蛋白濃度；根據(jù)目的蛋白相對分子質(zhì)量，配制分離膠、濃縮膠；經(jīng)歷上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后將膜完全浸沒于5%脫脂奶粉中，搖床孵育1h；然后將膜與相應(yīng)一抗一起孵育，4℃過夜；將膜與二抗一起孵育，室溫40min；最后曝光、定影。

6.RT-PCR實驗：應(yīng)用Trizol法提取細胞總mRNA，采用20 μl反轉(zhuǎn)錄體系獲得cDNA。用RT-PCR法檢測擴增基因片段，反應(yīng)條件：第1步50℃ 2min，第2步95℃ 10min，第3步95℃ 15s，第4步60℃ 1min，擴增40個循環(huán)。以熒光強度為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線，計算閾值。cGAS上游引物為5′-ATCTGCCTGCTTCTGCCATTGG-3′，下游引物為5′-GCGTGAGGACTTGAGTTGAGACC-3′；STING上游引物為5′-CCAAGAACCCACAGACGGAAACAG-3′，下游引物為5′-TCAGATGAGGTCAGTGCGGAGTG-3′；p65 NF-κB上游引物為5′-GGCTACACAGGACCAGGAACAGT-3′，下游引物為5′-TTGCTCCAGGT-CTCGCTTCTTCA-3′；TNF-α上游引物為5′-TAACTTAGAAAGGGGATTATGGCT-3′，下游引物為5′-TGGAAAGGTCTGAAGGTAGGAA-3′；IL-1β上游引物為5′-ACAAGGAGAACCAAGCAACGACAA-3′，下游引物為5′-TGTGAGGTGCTGATGTACCAGTTG-3′。

7.流式細胞術(shù)實驗：消化細胞，離心，PBS重懸，吸取細胞懸液于流式管內(nèi)，冰上孵育30min，應(yīng)用流式表面抗體F4/80、CD11b、CD86標(biāo)記M1型巨噬細胞, 應(yīng)用F4/80、CD11b、CD206標(biāo)記M2型巨噬細胞，添加熒光一抗，避光4℃孵育30min，洗滌，4℃，1000r/min，離心5min除去未結(jié)合的抗體，PBS重懸細胞沉淀后上流式細胞儀檢測。

結(jié) 果

1.STING在DN患者腎臟的表達及定位：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與NG組比較，DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細胞明顯浸潤、STING表達量明顯增加(圖1A)；免疫熒光雙染結(jié)果顯示，與NG組比較，DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細胞明顯浸潤、STING表達量明顯增加，且二者存在共定位(圖1B)。

圖1 正常對照及DN患者腎組織M1型巨噬細胞標(biāo)志物CD86及STING的表達A.免疫組織化學(xué)法；B.免疫熒光雙染法(×1000)

2.cGAS-STING信號通路對巨噬細胞活化表型的影響：流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組巨噬細胞主要向M1型(F4/80、CD11b、CD86陽性)巨噬細胞轉(zhuǎn)化，其比例明顯增加，STING抑制劑C-176可明顯降低HG組M1型巨噬細胞的比例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。各組M2型巨噬細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.cGAS-STING信號通路對下游p-p65 NF-κB表達的影響：Western blot法檢測及RT-PCR結(jié)果表明，HG組巨噬細胞cGAS、STING、p-p65 NF-κB的蛋白表達及mRNA表達量均明顯高于NG組，STING抑制劑C-176可明顯抑制STING、p-p65 NF-κB的蛋白及mRNA表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3和圖4)。

圖3 STING抑制劑C-176對cGAS-STING及p-p65 NF-κB蛋白表達的影響A.Western blot法檢測結(jié)果；B.cGAS相對表達量; C.STING相對表達量；D.p-p65 NF-κB相對表達量。與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

圖4 STING抑制劑C-176對cGAS-STING及p-p65 NF-κB mRNA表達的影響A.cGAS 相對表達量;B.STING相對表達量；C.p-p65 NF-κB 相對表達量。與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

4.cGAS-STING信號通路對下游炎性細胞因子表達的影響：RT-PCR結(jié)果表明HG組巨噬細胞炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達量均明顯高于NG組，STING抑制劑C-176可明顯抑制上述兩種指標(biāo)的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 STING抑制劑C-176對炎性細胞因子表達的影響(RT-PCR)A.TNF-α 相對表達量; B.IL-1β 相對表達量。與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

討 論

DN是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，DN導(dǎo)致的慢性腎衰竭已成為血液透析和腎移植的首位病因[6]。研究其發(fā)病機制、尋找新的治療靶點具有重大意義。

DN診斷標(biāo)準(zhǔn)：有明確DM病史，同時與尿蛋白、腎功能變化存在因果關(guān)系，并排除其他原發(fā)性、繼發(fā)性腎小球疾病與系統(tǒng)性疾病，符合以下3種情況之一者，可診斷DN。3種情況為隨機尿白蛋白/肌酐比值≥30mg/g或尿白蛋白排泄率≥30mg/24h，且在3～6個月內(nèi)重復(fù)檢查，3次中有2次達到或超過臨界值，并排除感染等其他干擾因素；估算腎小球濾過率<60ml/(min·1.73m2) 3個月以上；腎活檢符合DN病理改變[7]。

腎臟慢性微炎性狀態(tài)已被證實參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過程[1]。巨噬細胞活化在DN的炎性過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，DN早期，巨噬細胞作為最主要的炎性細胞浸潤在腎臟組織中。在DN中造成腎臟損傷的巨噬細胞主要是M1型巨噬細胞，主要表現(xiàn)為促炎、促損傷作用，其標(biāo)志物主要有iNOS、CD11c、CD68、CD86等。M2型巨噬細胞在主要發(fā)揮抗炎及促進組織修復(fù)的作用，標(biāo)志物主要有Arg-1、CD206、CD11b等[2, 8]。NF-κB 信號通路是參與DN巨噬細胞活化的主要胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在體內(nèi)持續(xù)高糖刺激下，成熟巨噬細胞活化為M1型巨噬細胞，NF-κB信號通路被激活后釋放大量炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β等，進而誘導(dǎo)腎臟局部慢性炎性反應(yīng)，促使腎小球系膜細胞基質(zhì)增生、成纖維細胞增殖、足細胞損傷等病理過程，最終加速腎臟纖維化[9, 10]。

STING在多種細胞中普遍表達，如巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞等[3]。最初對STING的研究主要集中在微生物感染性疾病，STING的激活始動于細胞質(zhì)內(nèi)異常DNA，如細菌及病毒DNA，cGAS能夠識別并結(jié)合異常DNA，通過自身結(jié)構(gòu)改變分解DNA合成環(huán)磷酸鳥苷酸腺苷酸，隨后激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STING，活化的STING離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，移動到細胞核周圍，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達，最終引發(fā)固有免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)[4, 11]。此外，STING還可直接激活NF-κB信號通路促進炎性反應(yīng)[12]。研究表明cGAS-STING通路的激活可能是多種慢性免疫炎性疾病的發(fā)病機制，如惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性胰腺炎等[13～15]。動物實驗表明抑制STING活性可明顯改善急性心肌梗死后小鼠的病理性心肌重塑[16]。在脂肪肝炎小鼠模型中，肝臟巨噬細胞STING表達增加，STING可通過介導(dǎo)巨噬細胞活化激活NF-κB信號通路、促進炎性細胞因子表達，誘發(fā)肝臟炎性及纖維化[17]。

目前cGAS-STING信號通路是否參與DN的調(diào)控尚不清楚，筆者推測在DN慢性微炎性狀態(tài)下，腎臟cGAS-STING通路極有可能表達上調(diào)。為驗證該假設(shè)，本研究檢測DN患者腎組織STING的免疫組織化學(xué)表達水平，并利用免疫熒光雙染技術(shù)對STING及巨噬細胞進行定位，結(jié)果表明DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細胞明顯浸潤、STING表達量明顯增加，且二者存在共定位。為進一步明確巨噬細胞cGAS-STING通路在DN中的作用，本研究應(yīng)用Western blot法、RT-PCR等技術(shù)對小鼠巨噬細胞RAW264.7進行體外實驗，給予高糖刺激，結(jié)果表明高糖環(huán)境下，巨噬細胞cGAS-STING信號通路被激活、巨噬細胞向M1型活化，同時p-p65 NF-κB信號蛋白表達上調(diào)、炎性細胞因子TNF-α和IL-1β釋放增加；加入STING抑制劑C-176可明顯抑制M1型巨噬細胞活化及下游炎性蛋白、炎性細胞因子的表達。以上結(jié)果證實，高糖環(huán)境下，巨噬細胞cGAS-STING信號通路被激活，該通路可進一步促進M1型巨噬細胞活化及下游炎性反應(yīng)。但高糖環(huán)境下cGAS-STING被激活的分子生物學(xué)機制目前仍不清楚。線粒體功能障礙已被證實參與DN的發(fā)生、發(fā)展，與高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)[18～20]。cGAS-STING通路可被線粒體損傷釋放入胞質(zhì)的線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)所激活[21]。因此推測，高糖環(huán)境下巨噬細胞極有可能發(fā)生線粒體功能障礙，隨之mtDNA逃逸至胞質(zhì)激活cGAS-STING信號通路，進而介導(dǎo)巨噬細胞活化。今后課題組擬進一步完成高糖環(huán)境下巨噬細胞的線粒體功能檢測。

綜上所述，本研究在人體水平證實STING在DN患者腎臟M1型巨噬細胞中表達上調(diào)。進一步通過細胞水平表明高糖環(huán)境下，cGAS-STING通路被激活并介導(dǎo)M1型巨噬細胞活化，進而促進下游炎性反應(yīng)。

本研究探索cGAS-STING信號通路在DN慢性免疫炎性反應(yīng)過程中的作用，初步闡明cGAS-STING介導(dǎo)巨噬細胞活化、促進下游炎性反應(yīng)的生物學(xué)功能。今后將繼續(xù)探討該通路介導(dǎo)巨噬細胞活化的分子生物學(xué)機制，并進行動物實驗進一步加以驗證。該研究擬為DN的分子免疫治療提供新的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。