血清趨化素Chemerin及相關炎性細胞因子在非酒精性脂肪性肝病中的作用

吳明奇 楊晴柔 徐素美 陳芝蕓

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與肥胖及胰島素抵抗相關的代謝性慢性肝臟損傷疾病。目前，NAFLD在全球各地的平均發生率約為24%[1]。其中，20%～30% NAFLD患者會進展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，嚴重者可導致進行性肝纖維化和肝硬化甚至肝細胞癌[2]。趨化素Chemerin是新發現的一個脂肪細胞因子，有調節脂質代謝功能，并可通過刺激巨噬細胞上調CCL2、TNF-α等炎性介質的表達，誘發或加劇肝內的炎性反應[3,4]。本研究觀察NAFLD患者血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平變化，并分析其與肝細胞損傷、糖脂代謝等的關系，探討血清趨化素Chemerin及其相關炎性細胞因子在NAFLD發生、發展中的作用和意義。

對象與方法

1.研究對象：收集2018年4～6月浙江中醫藥大學附屬第一醫院下沙院區體檢中心受檢并診斷為脂肪肝，且符合診斷標準、納入標準及排除標準的患者110例，患者平均年齡為42.8±9.0歲，對入選患者進行流行病學問卷調查。同期納入50例體檢指標無異常，且除外相關肝病、可導致脂肪肝的相關疾病，以及各種嚴重慢性疾病的體檢人群作為對照組，平均年齡為42.4±9.1歲。NAFLD組納入標準：①年齡：18～65周歲；②符合NAFLD診斷標準，即參考中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組編寫的《中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》[5]。對照組納入標準：①年齡：18～65周歲；②同一批體檢人群中，明確排除NAFLD的健康體檢者，且不飲酒者(無飲酒史或飲酒折合乙醇量男性<140克/周，女性<70克/周)。排除標準：①無病毒性肝炎、藥物性肝炎等肝病；②自身免疫性疾病、胃腸外營養疾病、甲狀腺功能減退等可導致脂肪肝的疾病；③心功能不全、腎功能不全、免疫缺陷性等各種嚴重慢性疾?。虎懿慌浜险{查或資料不全者。研究方案經浙江中醫藥大學附屬第一醫院醫學倫理學委員會審批并備案。

2.主要試劑：Human Premixed Multi-Analyte(Chemerin、CCL2、TNF-α)Kit，購自美國Bio-Techne公司(目錄號LXSAHM-07)；葡萄糖檢測試劑盒(產品號05168791190)、天冬氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒(ALT)(產品號05850819190)、丙氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒(產品號05850797190)、谷氨酰轉肽酶(GGT)檢測試劑盒(產品號37435801)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒(產品號35652201)、總膽固醇(TC)檢測試劑盒(產品號37225401)購自羅氏診斷產品有限公司；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(產品號92649105)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒(產品號92650120)購自中生北控生物有限公司。

3.主要儀器：Bio-Plex 200液相懸浮芯片系統為美國Bio-Rad公司產品；DX800型全自動血細胞分析儀型號為美國貝克曼公司產品；羅氏cobas8000全自動生化儀為瑞士羅氏診斷公司產品；LOGIG 500型超聲診斷儀為美國GE公司產品。

4.研究方法：形體學參數檢測：受檢者脫鞋帽、穿單衣，由專人使用同一工具采用標準方法測量其體重、身高，分別精確到0.1kg和0.1cm，并計算體重指數(BMI)=體重(kg)/身高2(m2)。血壓測定：使用啟達QD-YTJ-A血壓監測工作站測定血壓，以坐立位休息5min以上，測定收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)。肝臟B超檢測：采用LOGIG 500型超聲診斷儀[探頭頻率(3.5～5.0)MHz]行肝臟 B 超檢查。生化指標檢測：受檢者在禁食8～12h后，次日晨采集空腹靜脈血，采用全自動生化儀檢測血糖、血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)和肝功能(ALT、AST、GGT)。采用 Luminex液相芯片法Bio-Plex 200 system高通量分析平臺(Bio-Rad公司)檢測血清中Chemerin、CCL2、TNF-α水平，操作步驟嚴格按照試劑盒提供的說明書進行規范化、標準化操作，通過配套的Bio-Plex Manager 軟件包進行數據測定及分析，根據試劑盒提供的標準品做標準曲線(圖1～圖3)，根據標準曲線得出最終數值，保證結果的可靠性、準確性。

圖1 Chemerin標準曲線

圖2 CCL2標準曲線

圖3 TNF-α標準曲線

結 果

1.NAFLD患者性別、BMI、血壓、血糖、血脂、肝功能變化的變化：NAFLD組男性患者占較高比例，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；NAFLD組BMI、血糖、血壓(收縮壓及舒張壓)、TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT、水平顯著高于對照組(P<0.01)，HDL-C水平則顯著低于對照組(P<0.01)，詳見表1。

表1 NAFLD患者性別、BMI、血壓、血糖、血脂、肝功能變化

2.NAFLD患者血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平的變化：NAFLD組血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平均顯著高于對照組(P<0.01)，詳見表2。

表2 NAFLD患者Chemerin、CCL2、TNF-α的變化

討 論

液相芯片是一種非常靈活的多功能技術平臺，可進行蛋白、核酸等生物大分子檢測及酶學分析、受體和配體識別分析等研究，被喻為后基因組時代的芯片技 術。與傳統的ELISA法比較，具有快速、經濟、高效的特點，對于以人群為目標臨床大樣本取樣的研究，更是具有節省樣體量的優勢。本研究所使用的Bio-Plex Pro 200系統整合了雙激光、激流系統和實時數據處理系統，特有的系統校正和校驗工具，以進行內部質控，確保實驗數據的精確性。

本組研究對象為浙江中醫藥大學附屬第一醫院體檢人群，職業以公務員、企事業單位人員為主，研究結果提示，NAFLD組男女性別之比為97∶13，男性占比88.2%，明顯高于女性，性別之間發生率的差異可能與男性、女性之間體內不同的激素調控相關[6]。

根據世界衛生組織全球衛生觀察站2014年的數據表明，NAFLD發生率與肥胖指數密切相關[7]。本組資料也發現，NAFLD組較對照人群有更高的BMI指數。本研究NAFLD組較對照人群有更高的空腹血糖、TG、TC及LDL-C水平，而HDL-C較對照人群明顯下降，提示NAFLD患者存在機體糖、脂代謝功能異常；同時，NAFLD組較對照組有更高的血壓水平；這些結果也進一步表明NAFLD與代謝綜合征關系密切，是代謝綜合征在肝臟的表現[8]。

Chemerin主要由白色脂肪組織釋放，在肝臟和肺中高度表達；通過刺激、誘導脂肪細胞和血管內皮細胞的增值、分化，以影響體內脂肪組織代謝平衡[9]。本研究發現NAFLD組較對照組血清趨化素Chemerin水平明顯增高。Kajor等[10]研究發現，與體重指數≤40kg/m2的患者比較，體重指數>40kg/m2的患者血清趨化素Chemerin水平明顯升高，說明血清趨化素Chemerin與肥胖關系密切。由于本組NAFLD患者中，BMI均≤40kg/m2(最高為35.22kg/m2)，為了評估BMI與血清趨化素Chemerin相關性，本研究根據中國肥胖問題工作組建議，將BMI值分為3組，即18.5～23.9kg/m2為正常組，24～27.9kg/m2為超重組，≥28kg/m2為肥胖組，結果提示血清趨化素Chemerin水平隨BMI值的增高而增高(正常組為615.3±420.6pg/ml；超重組為1014.6±825.9pg/ml；肥胖組為1284.9±838.3pg/ml)，且正常組明顯低于超重組和肥胖組，差異有統計學意義(P<0.01)，但超重組(n=65)與肥胖組(n=42)之間比較，差異無統計學意義[11]。本研究發現，MS相關標志物BMI(R=0.269，P<0.01)、TG(R=0.318，P<0.01)、SBP(R=0.310，P<0.01)、DBP(R=0.282，P<0.01)、血糖(R=0.242，P<0.05)與血清趨化素Chemerin呈正相關，HDL-C(R=-0.335，P<0.01)與血清趨化素Chemerin呈負相關，說明MS與血清趨化素Chemerin可能存在相關性。Kim等[12]研究發現通過改變飲食或加強鍛煉可降低體重超重者、肥胖2型糖尿病患者血清趨化素Chemerin水平，也支持MS與血清趨化素Chemerin可能存在相關性這一觀點。

CC趨化因子2(C-C motif chemokineligand 2，CCL2)又稱單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是與CC趨化因子2受體 (C-C motif chemokineligand receptor2，CCR2)的主要配體，兩者高親和力的結合、活化后，能誘導肝內發生免疫和炎性反應[13]。動物實驗證明，腸源性脂多糖和游離脂肪酸通過激活巨噬細胞表面的TLR-4，激活巨噬細胞的促炎程序，誘導巨噬細胞分泌CCL2、TNF-α等細胞因子[14]。趨化素Chemerin與其趨化因子樣受體1(CMLKR-1)的結合促進巨噬細胞和自然殺傷細胞向組織損傷部位的活化，參與炎性反應[15]。本實驗發現，NAFLD組較對照組有更高的CCL2、TNF-α水平，同時發現血清趨化素Chemerin與CCL2(R=0.490，P<0.01)、TNF-α(R=0.308，P<0.01)均呈正相關。由此，進一步分析了血清趨化素Chemerin與肝細胞損傷的相關指標的關系，結果發現，血清趨化素Chemerin與ALT(R=0.275，P<0.01)、AST(R=0.233，P<0.01)、GGT(R=0.359，P<0.01)均呈正相關，表明血清趨化素Chemerin可能參與了NAFLD的炎性反應。

筆者觀察到，血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α等炎性細胞因子水平在不同的NAFLD患者中個體差異比較大，分析原因可能與本組資料均為體檢患者，未進行單純性脂肪肝、NASH的分組分析有關。若需進一步的研究，需要擴大樣本量，同時有必要通過超聲、磁共振彈性成像等技術進行NAFLD嚴重程度分級，這樣可望得出更能反映NAFLD炎性細胞因子與肝臟不同程度脂肪變相對比的結果。迄今為止的大多數研究表明，血清趨化素Chemerin與NAFLD有關聯，但血清趨化素Chemerin和肝趨化素Chemerin mRNA之間尚未發現可靠的相關性，需要在未來的研究中加以關聯和擴展。