PD-L1胞外域密碼子優(yōu)化及原核表達純化

方 宇 呂 艦 王志華

以T細胞為基礎(chǔ)的免疫系統(tǒng)可識別和破壞異常細胞，如病原體感染的細胞和癌細胞。T細胞表面的T細胞受體(T cell receptor, TCR)與靶細胞表面的主要組織相容性復(fù)合(major histocompatibility complexes, MHC)的特異性結(jié)合在很大程度上受到一系列共刺激和共抑制受體及其配體(也稱為免疫檢查點)的控制[1]。免疫檢查點通路通過調(diào)節(jié)抗原特異性T細胞的數(shù)量和功能活性，在限制組織損傷和維持自身耐受性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。其中，程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)/程序死亡配體1(programmed death-ligand 1， PD-L1)通路因其被證明是大量惡性腫瘤的治療靶點而脫穎而出[3]。

1992年，PD-1的基因結(jié)構(gòu)被首次發(fā)現(xiàn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，PD-1的特異性配體，PD-L1在許多惡性腫瘤細胞中大量表達，PD-1/PD-L1的結(jié)合會導(dǎo)致腫瘤細胞免疫逃逸[4]。T細胞在抗原刺激下活化，產(chǎn)生大量的細胞因子參與免疫反應(yīng)。但同時產(chǎn)生的干擾素γ會導(dǎo)致腫瘤細胞表面PD-L1增多，腫瘤細胞表面的PD-L1與T淋巴細胞表面的PD-1發(fā)生特異性結(jié)合，會抑制效應(yīng)T淋巴細胞的活性并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細胞逃逸機體的免疫系統(tǒng)。因此，靶向PD-1/PD-L1免疫檢查點，特異性阻斷PD-1/PD-L1信號通路，可轉(zhuǎn)化為臨床抗腫瘤的方法。目前經(jīng)FDA批準的PD-1/PD-L1單抗藥物已用于治療黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎癌、霍奇金淋巴瘤、頭頸部腫瘤、膀胱癌等[4～6]。

有研究報道，可通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選與靶蛋白特異性結(jié)合的DNA/RNA 適配體，通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路從而抑制腫瘤的免疫逃逸[7～10]。SELEX篩選的DNA/RNA 適配體存在以下優(yōu)勢：①可與靶蛋白實現(xiàn)特異性結(jié)合；②由于相對分子質(zhì)量小，對腫瘤的穿透能力強，且在體內(nèi)易降解消除，免疫原性較低；③與抗體比較，DNA/RNA適配體易于合成、運輸、保存等。因此，針對PD-1/PD-L1的胞外結(jié)合區(qū)域篩選特異性的DNA/RNA 適配體，以阻斷腫瘤的免疫逃逸，也為治療惡行腫瘤提供了一種新思路。

本實驗通過體外合成PD-L1胞外域?qū)?yīng)的基因序列，重組轉(zhuǎn)化至E.coli原核表達載體中，隨后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達，通過密碼子優(yōu)化使目的蛋白在菌液上清中表達，最終采用鎳離子螯合純化樹脂，得到了PD-L1胞外域目的蛋白，為后續(xù)篩選識別PD-L1胞外域特異性DNA/RNA 適配體提供實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

1.質(zhì)粒、菌株及細胞載體pET-28a(+)，感受態(tài)E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)購自淼靈質(zhì)粒平臺；293T細胞取自武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實驗室。

2.主要試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)基(高糖，含丙酮酸鈉)、Gibco澳洲胎牛血清、蛋白marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、超聲破碎機購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；青霉素鏈霉素溶液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；KOD-Plus-Neo購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；DNA marker、RNAiso Plus (trizol)試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；瓊脂糖購自廣州賽國生物科技有限公司；卡那霉素、IPTG購自默克生命科學(xué)有限公司；鎳離子螯合純化樹脂(complete His-Tag Purification Resin)購自上海羅氏制藥有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3.目的基因擴增：293T細胞采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基加入10%的Gibco澳洲胎牛血清、1%的青霉素鏈霉素溶液)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。采用RNAiso Plus(trizol)試劑提取293T細胞總RNA，并根據(jù)試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)NCBIGene子數(shù)據(jù)庫中人源PD-L1(NM_014143)基因序列，采用Primer3Plus設(shè)計特異性引物。引物序列為：上游引物為5′-CCTGCAGGGCATTCCAGAAA-3′，下游引物為5′-TCCCTGCTTGAAGATCAGAAGT-3′。按KOD-Plus-Neo配制PCR反應(yīng)體系，98℃預(yù)變性5min，98℃變性30s，60℃退火20s，68℃延伸30s，變性、退火、延伸35個循環(huán)，最后68℃再延伸5min，獲取目的基因DNA片段。將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，隨后通用型DNA純化回收試劑盒純化目的片段。

4.重組質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)Uniport數(shù)據(jù)庫中人源PD-L1的細胞膜外段(Position 19-238氨基酸)，設(shè)計特異性重組引物。重組引物序列如下：上游引物為5′-TTAAGAAGGAGATATACCATGTTTACTGTCACG-GTTCCCAAG-3′，下游引物為5′-ATGGTCTTTGTAGTCGCTAGCCCTTTCATTTGGAGGATGTGC-3′。將上一步純化得到的DNA片段作為模板，PCR反應(yīng)體系同上，獲取目的基因DNA片段。將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，隨后通用型DNA純化回收試劑盒純化重組目的片段。載體雙酶切：將帶有6×His標簽的pET-28a(+)載體經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切37℃水浴過夜，雙酶切產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，隨后通用型DNA純化回收試劑盒純化得到雙酶切后載體。將重組目的片段與雙酶切載體于37℃反應(yīng)30min，進行重組反應(yīng)。隨后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α，涂布于LB培養(yǎng)基(Kan+)上，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。次日，將菌液送測序，將測序正確的菌液提取質(zhì)粒DNA。最后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21中，得到PD-L1表達菌株，命名為pET-28a-PD-L1-6×His，為后續(xù)原核表達做準備。

5.重組蛋白誘導(dǎo)表達條件篩選：將測序正確的pET-28a-PD-L1-6×His菌株置于37℃ 220r/min恒溫搖床中過夜至平臺期。次日按1∶50接種至5ml LB培養(yǎng)基(Kan+)中，37℃220r/min恒溫搖床中培養(yǎng)至對數(shù)增長期，A600值為0.4～0.8，約1.5～2.0h，取少量誘導(dǎo)前菌液樣本保留，隨后按表1所示的誘導(dǎo)條件，繼續(xù)誘導(dǎo)4h。取少量誘導(dǎo)后菌液樣品保留，隨后將剩余菌液12000r/min，離心3min，加入1ml 1×PBS重懸；冰浴超聲，80%功率，超聲2s，停2s，2～5min直至菌液清亮；再次離心12000r/min，離心5min，分離上清和沉淀，取少量上清及沉淀樣品與之前保留的誘導(dǎo)前菌液、誘導(dǎo)后菌液一起與蛋白上樣緩沖液混合均勻，95℃加熱10min制備蛋白樣本，進行Western blot法檢測。

表1 誘導(dǎo)條件的篩選

6.大規(guī)模誘導(dǎo)目的蛋白表達：恒溫搖床中過夜至平臺期的pET-28a-PD-L1-6×His菌株按1∶50接種至500ml LB培養(yǎng)基(Kan+)中，37℃ 220r/min恒溫搖床中培養(yǎng)至對數(shù)增長期，A600值為0.4～0.8，約1.5～2.0h。隨后采用0.1mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)4h。將菌液分成兩管，7500r/min離心3min收集菌液，分別加入20ml PBS重懸后，冰浴超聲，80%功率，超聲2s，停2s，1h直至菌液清亮, 離心收集上清或沉淀用于后續(xù)純化過程。

7.包涵體洗脫及蛋白復(fù)性：若目的蛋白表達在沉淀中，便采用變性洗脫包涵體沉淀得到PD-L1目的蛋白。首先采用10ml Buffer A(50mmol/L Tris，pH值為8)重懸包涵體沉淀，12000r/min離心10min棄上清，清洗兩遍；隨后采用10ml Buffer B(50mmol/LTris、2mol/L尿素，pH值為8)重懸包涵體沉淀，12000r/min離心10min棄上清，清洗兩遍；最后采用5ml變性液(0.1mol/L Tris、8mol/L尿素，pH值為8)重懸沉淀，37℃搖床孵育1h使包涵體完全溶解，12000r/min離心10min取上清，得到變性目的蛋白溶液。隨后，將目的蛋白的變性溶液裝于半透膜中，利用尿素濃度梯度配制復(fù)性液A～E，主要成分(1×PBS、10%甘油、2mmol/L還原型GSH、0.2mmol/L GS-SG氧化型)不變，尿素濃度由5、3、2、1、0mol/L依次遞減，每遍均于4℃透析12h。

8.稀有密碼子優(yōu)化：為提高PD-L1胞外域在上清中誘導(dǎo)表達，進行天然蛋白的純化，將PD-L1胞外域?qū)?yīng)核苷酸序列進行稀有密碼子優(yōu)化。通用生物公司將稀有密碼子替換、考慮GC比例，優(yōu)化后的基因序列及氨基酸序列如下圖(圖1)。隨后將優(yōu)化后的目的基因序列構(gòu)建至pET-28a表達載體中，轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21中，得到NewPD-L1表達菌株，命名為pET-28a-newPD-L1-6×His。

圖1 PD-L1基因序列及氨基酸序列優(yōu)化前后對A.基因序列優(yōu)化前后對比結(jié)果；B.氨基酸序列優(yōu)化前后對比結(jié)果；1.優(yōu)化前基因序列；2.優(yōu)化后基因序列

9.鎳離子螯合純化樹脂純化目的蛋白：將大規(guī)模誘導(dǎo)后得到上清液進行后續(xù)的鎳柱親和層析純化目的蛋白，具體純化步驟如下。將3ml鎳離子螯合純化樹脂用20ml平衡液(50mmol/L二水合硫酸二氫鈉、300mmol/L氯化鈉，pH值為8)進行柱平衡，流速1ml/min。隨后，將上清液通過鎳離子螯合純化樹脂，流速0.5ml/min，流通兩遍。采用20ml流通液(50mmol/L二水合硫酸二氫鈉、300mmol/L氯化鈉、25mmol/L咪唑，pH值為8)通過樹脂，流速1ml/min，去除樹脂上非特異性蛋白。隨后，用5ml洗脫液(50mmol/L二水合硫酸二氫鈉、300mmol/L氯化鈉、250mmol/L咪唑，pH值為8)，流通樹脂兩遍，收集目的蛋白。最后，將目的蛋白洗脫液裝入透析袋，于透析液中(1×PBS+5%甘油)4℃透析過夜，去除殘留的咪唑，用蔗糖濃縮目的蛋白，液氮速凍后，-80℃保存。

結(jié) 果

1.PD-L1胞外域目的蛋白誘導(dǎo)條件篩選：本研究篩選了IPTG誘導(dǎo)濃度1mmol/L或0.1mmol/L，誘導(dǎo)溫度37℃或16℃。實驗結(jié)果表明，與誘導(dǎo)前的菌液比較，不同條件下誘導(dǎo)后的菌液在26kDa附近均有特異性目的蛋白過表達，表明目的蛋白能成功表達。此外，1mmol/L和0.1mmol/L IPTG均能誘導(dǎo)目的蛋白表達，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而在不同誘導(dǎo)溫度下，PD-L1的蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在37℃誘導(dǎo)溫度下，目的蛋白的表達顯著高于16℃(圖2)。不同的誘導(dǎo)條件下，目的蛋白均在細菌裂解的沉淀中，而非裂解的上清中。因此，后續(xù)大規(guī)模誘導(dǎo)蛋白表達采用誘導(dǎo)溫度37℃，0.1mmol/L IPTG。

圖2 PD-L1原核表達誘導(dǎo)條件篩選A.誘導(dǎo)前細菌樣本；B.誘導(dǎo)后細菌樣本；C.誘導(dǎo)后細菌裂解上清液；D.誘導(dǎo)后細菌裂解沉淀；M.蛋白marker

2.大規(guī)模誘導(dǎo)表達及包涵體變性純化：于37℃，0.1mmol/L IPTG條件下大規(guī)模誘導(dǎo)表達，結(jié)果與圖2一致，目的蛋白均能在沉淀中大量表達，因此后續(xù)采用溶解包涵體的方式純化目的蛋白。結(jié)果如圖3所示，對PD-L1胞外域目的蛋白的包涵體洗脫后，能得到純度較高的目的蛋白，但在目的蛋白復(fù)性過程中，目的蛋白均析出。考慮到目的蛋白變性的洗脫方法無法成功純化得到目的蛋白，為此需使目的蛋白表達于上清中，采用非變性的鎳柱親和層析純化。因此，后續(xù)實驗中對目的蛋白的基因序列進行了稀有密碼子優(yōu)化。

圖3 PD-L1原核表達大規(guī)模誘導(dǎo)及包涵體洗脫A.誘導(dǎo)前細菌樣本；B.誘導(dǎo)后細菌樣本；C.誘導(dǎo)后細菌裂解上清液；D.誘導(dǎo)后細菌裂沉淀；E. 誘導(dǎo)后細胞包涵體洗脫；M.蛋白marker

3.密碼子優(yōu)化后目的蛋白誘導(dǎo)條件篩選：根據(jù)圖1可以發(fā)現(xiàn)，利用密碼子的簡并性，稀有密碼子的優(yōu)化并未改變PD-L1胞外域蛋白氨基酸序列，優(yōu)化后的PD-L1胞外域蛋白保持原有的抗原性及生物活性。經(jīng)過稀有密碼子優(yōu)化后，筆者仍按表1方式篩選目的蛋白誘導(dǎo)表達條件。篩選結(jié)果如圖4所示，1mmol/L和0.1mmol/LIPTG均能誘導(dǎo)目的蛋白表達，且兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同的誘導(dǎo)溫度，目的蛋白的表達模式有顯著差別。37℃的誘導(dǎo)溫度下，目的蛋白在沉淀中大量表達，但在上清裂解液中無明顯表達。16℃的誘導(dǎo)溫度下，雖然目的蛋白的表達量大大減少，但在上清裂解液中表達成功。考慮到目的蛋白需采用非變性的鎳離子螯合樹脂純化。因此，稀有密碼子優(yōu)化后采用的最佳誘導(dǎo)條件為16℃，0.1mmol/L IPTG，誘導(dǎo)12h。

圖4 基因優(yōu)化后PD-L1原核表達誘導(dǎo)條件篩選A.誘導(dǎo)溫度37℃的原核表達結(jié)果；B.誘導(dǎo)溫度16℃的原核表達結(jié)果。1.誘導(dǎo)前細菌樣本；2.誘導(dǎo)后細菌樣本；3.誘導(dǎo)后細菌裂解上清液；4.誘導(dǎo)后細菌裂解沉淀；M.蛋白marker

4.鎳離子螯合樹脂純化目的蛋白：經(jīng)稀有密碼子優(yōu)化后，PD-L1胞外域目的蛋白于16℃，0.1mmol/L IPTG條件下進行大規(guī)模誘導(dǎo)表達，并將細菌超聲裂解后的上清液通過鎳離子螯合樹脂進行親和層析純化。實驗結(jié)果如圖5，在該誘導(dǎo)條件下，目的蛋白仍大量表達于包涵體中，但有小部分以可溶方式表達于上清中，通過親和層析后，成功得到了較高純度的目的蛋白。綜上所述，通過優(yōu)化稀有密碼子后，可使PD-L1胞外域目的蛋白少量表達于細菌裂解上清中，通過鎳柱親和層析可純化純度較高的目的蛋白，為后續(xù)的實驗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 PD-L1原核表達大規(guī)模誘導(dǎo)及親和層析純化A.誘導(dǎo)前細菌樣本；B.誘導(dǎo)后細菌樣本；C.誘導(dǎo)后細菌裂解上清液；D.誘導(dǎo)后細菌裂沉淀；E. 誘導(dǎo)后細菌裂解上清液親和層析純化；M.蛋白marker

討 論

目前，PD-1/PD-L1免疫檢查點療法仍存在很多問題，如不同類型的腫瘤對PD-1/PD-L1抗體的敏感程度不同；免疫系統(tǒng)的非特異性激活[11～13]。某些患者接受治療后加速腫瘤進程。SELEX技術(shù)可從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出與靶蛋白特異性結(jié)合的核酸適配體，可為PD-1/PD-L1免疫檢查點療法提供一個新的思路[7～10]。本研究通過篩選IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度、密碼子優(yōu)化，最終成功表達、純化PD-L1胞外域片段，為后續(xù)的SELEX篩選PD-L1 適配體提供了實驗基礎(chǔ)。

與繁瑣、復(fù)雜且蛋白得率低的真核表達系統(tǒng)比較，基于大腸桿菌的原核表達系統(tǒng)簡單易行、目的蛋白得率高，已成為獲取目的蛋白的常規(guī)方法[14～17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在密碼子優(yōu)化前后，0.1mmol/L與1mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度均可成功誘導(dǎo)目的蛋白表達，且兩者間無明顯差異。而誘導(dǎo)溫度不僅影響目的蛋白的誘導(dǎo)效率，還會影響目的蛋白的表達模式。筆者發(fā)現(xiàn)在密碼子誘導(dǎo)前后，誘導(dǎo)溫度越高，目的蛋白的誘導(dǎo)效率越高。此外，通過稀有密碼子優(yōu)化后，16℃低溫誘導(dǎo)表達可使目的蛋白表達于細菌裂解上清中，可能是因為低溫使蛋白表達效率降低的同時，改善了蛋白的空間構(gòu)想，使其正常折疊。

真核生物的蛋白在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中，由于缺乏某些蛋白質(zhì)折疊輔助因子或環(huán)境不適，易形成包涵體[11]。此外，不同物種間存在明顯的密碼子偏好，若使用頻率低的稀有密碼子大量存在，會嚴重減小目的蛋白的表達水平，甚至?xí)斐牲c突變或移碼突變表達出序列錯誤的多肽[12, 18～20]。目的蛋白中含有大量稀有密碼子，最直接、高效的方法是對目的蛋白進行稀有密碼子優(yōu)化，可改善蛋白的空間構(gòu)象，使其正常折疊，從而減少包涵體的形成并保持生物活性實現(xiàn)可溶性的表達[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在密碼子優(yōu)化前，在最優(yōu)篩選條件下，PD-L1蛋白仍在包涵體中表達，并在蛋白復(fù)性析出最終無法得到目的蛋白。而在密碼子優(yōu)化后，采用16℃，0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)12h可使PD-L1目的蛋白以可溶狀態(tài)少量表達于細菌裂解上清液中，隨后通過鎳離子螯合純化樹脂得到了少量的PD-L1胞外域目的蛋白。

綜上所述，本研究表達、純化了PD-L1胞外域目的片段，為PD-L1的其他相關(guān)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)篩選PD-L1胞外域特異性結(jié)合的核酸適配體提供了實驗基礎(chǔ)。SELEX利用該技術(shù)可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體[7～10]。若利用SELEX技術(shù)篩選得到的特異性適配體能阻斷PD-1/PD-L1間的結(jié)合，則能為腫瘤逃逸的防治提供新的思路與方向。