ZEB1在卵巢子宮內膜異位癥中的表達及功能研究

袁 明 汪雯雯 宋 佳

子宮內膜異位癥(簡稱內異癥)是婦科常見的雌激素依賴性疾病，主要導致慢性盆腔痛、痛經及不孕等[1]。雖然內異癥為婦科良性疾病，但具有腫瘤的惡性生物學行為，如具有侵襲性、轉移潛能及術后易復發等，給患者造成嚴重的經濟及心理負擔[2]。因此，探究內異癥的惡性生物學行為的機制對尋找新的分子治療靶點具有重要臨床意義。轉錄因子ZEB1屬于鋅指同源家族成員，通過鋅指結構與下游靶基因啟動子區的E-box序列結合發揮作用。ZEB1在人類多種癌癥中異常表達，主要參與調控上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT) 促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移，以及調控腫瘤細胞化療敏感度[3,4]。EMT是重要的細胞重塑過程，其特征是上皮表型逐漸喪失，間充質表型逐漸增加。近年來，越來越多的證據表明EMT參與內異癥的發病機制[5～7]。作為EMT調控的重要轉錄因子，筆者推測ZEB1在子宮內膜異位癥的發病過程中亦可能發揮重要作用。本研究通過檢測ZEB1在卵巢子宮內膜異位癥中的表達情況，初步探討ZEB1在內異癥中的功能，為內異癥的診療提供新的思路。

資料與方法

1.臨床資料及標本采集：選取2010年1月1日～2011年12月31日在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院因卵巢子宮內膜囊腫行手術治療的患者30例為研究組，留取卵巢囊壁組織。選取同期因婦科良性疾病(子宮平滑肌瘤17例，不孕癥13例)住院行手術治療的患者30例為對照組，留取正常內膜組織。組織標本部分行石蠟包埋，剩余組織液氮速凍后超低溫冰箱保存。臨床資料及臨床標本的采集工作經華中科技大學醫學倫理學委員會討論并通過。

2.主要試劑：DF12培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自浙江天杭生物技術有限公司，Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma-Aldrich公司，DNaseⅠ酶購自中國碧云天生物技術研究所，Rever Tra Ace qPCR RT Kit購自日本TaKaRa公司，SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自美國ABI公司，所有引物由上海Invitrogen公司合成，普通PCR試劑購自美國Fermentas公司，ZEB1多克隆抗體購自美國Santa公司。CCK8 試劑盒購自日本Dojind公司。Matrigel膠購自美國BD公司， Transwell小室購自美國Milipore公司。

3.石蠟切片免疫組織化學：組織標本經10%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，切片3μm厚。組織切片脫蠟再水化。3%H2O2抑制內源性過氧化物酶活性，檸檬酸緩沖液于微波爐行抗原恢復。3%牛血清白蛋白阻斷后一抗孵育切片，抗ZEB1(兔抗1∶200)，DAB顯色。

4.原代子宮內膜間質細胞的培養及轉染：正常子宮內膜組織充分剪碎，經膠原酶B(10μg/ml)消化后收集細胞。培養基DF12重懸細胞，經400目濾網得到子宮內膜間質細胞,接種于細胞培養瓶。24h后胰酶消化細胞,接種6孔板，待細胞貼壁生長、細胞融合度達到70%左右時，根據Invitrogen的轉染試劑Lipo 2000的步驟行轉染實驗，觀察組每孔用200μl DF12稀釋4μg pCI-neo-ZEB1，加入6μl脂質體Lipo 2000；對照組轉染空質粒pCI-neo。于轉染后72h收集細胞渣行Western blot法檢測。

5.RNA提取及qRT-PCR：按Trizol說明書提取卵巢囊壁組織、正常內膜組織及轉染后的細胞渣的總RNA，Nano drop 2000檢測RNA純度，取2μg總RNA反轉錄成cDNA進行qRT-PCR反應。反應條件：95℃ 1min變性; 95℃ 15s；60℃ 45s；72℃ 30s共40個循環；95℃ 15s; 60℃ 15s; 95℃ 15s收集熒光。以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔct計算各組ZEB1的相對表達差異。

6. Western blot法檢測:轉染后分別收集兩組細胞提取總蛋白，按照試劑盒的操作步驟進行蛋白定量。取60μg 蛋白進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據 marker蛋白分離條帶，切下電泳后目的蛋白凝膠。電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，一 抗(稀釋濃度為ZEB1 1∶1000和GAPDH 1∶8000)4℃孵育過夜。室溫洗膜，于HRP標記的二抗溶液中37℃孵育1h,ECL顯色，采用Chemi-genius凝膠成像系統分析蛋白條帶相對表達量。

7.CCK-8檢測細胞增殖情況：培養瓶中原代培養的內膜間質細胞胰酶消化后，調整細胞濃度以1×104個/孔均勻接種于96孔板, 待孔板中細胞融合度達到85%時, 轉染pCI-neo-ZEB1及空質粒pCI-neo,每組各5個復孔。于轉染后24、48、72h加入CCK8, 37℃孵育2h,全能酶標儀(UQUA38 型)檢測570nm吸光度(A)值。

8. Transwell侵襲小室法檢測細胞的侵襲、轉移能力：收集轉染后的內膜間質細胞,用無血清DF12調整細胞濃度為2×104個/毫升，在Transwell孔板上室加入200μl細胞懸液，下室加入600μl DF12完全培養液。4%多聚甲醛固定濾膜，結晶紫染色10min，高倍顯微鏡計數穿透到濾膜下層的細胞數，每孔隨機選擇5個視野，結果求平均值。侵襲實驗在Transwell小室半透膜表面包被按1∶8比例稀釋的50mg/L matrigel(每孔100μl)置37℃培養箱中，30min成凝膠，再向上室加入細胞懸液，余同前述，各項實驗重復3次。

結 果

1.ZEB1在正常子宮內膜及異位子宮內膜組織中的表達情況：qRT-PCR檢測ZEB1 mRNA在正常子宮內膜及異位子宮內膜組織中的表達情況。發現ZEB1 mRNA在異位子宮內膜組織中異常高表達，且分泌期的表達高于增生期，差異有統計學意義(圖1A)。免疫組化法檢測ZEB1在增生期及分泌期正常子宮內膜組織、異位子宮內膜組織中蛋白水平的表達差異。結果發現，在正常子宮內膜組織中，ZEB1蛋白主要定位于子宮內膜的間質細胞的胞核，分泌期表達高于增生期；而在異位內膜中組織中，ZEB1蛋白除在子宮內膜的間質細胞的胞核中表達，還見于異位內膜的腺上皮細胞中(圖1B)。

圖1 ZEB1在正常子宮內膜及異位子宮內膜組織中的表達情況A.ZEB1 mRNA在正常子宮內膜及異位子宮內膜組織中的表達情況;B.ZEB1在正常子宮內膜及異位子宮內膜組織中免疫組化染色(×400)

2.鑒定質粒轉染效率：分別收集轉染后48h及72h的細胞渣，qRT-PCR及Western blot法分別檢測ZEB1 mRNA及蛋白表達變化，可見轉染pCI-neo-ZEB1后子宮內膜間質細胞中ZEB1的mRNA及蛋白表達均明顯升高(圖2)。

圖2 轉染重組質粒后ZEB1的表達A.轉染后，間質細胞ZEB1蛋白的表達；B.轉染后，間質細胞ZEB1mRNA的表達

3.ZEB1對子宮內膜間質細胞增殖的影響：CCK-8法檢測兩組細胞增殖能力，結果顯示ZEB1重組質粒組間質細胞在 24、48和72h時的增殖率均明顯高于空白質粒組(P<0.05)，上調正常子宮內膜間質細胞中的ZEB1后，間質細胞的增殖率明顯提高(圖3)。

圖3 ZEB1對子宮內膜間質細胞增殖的影響與空白質粒組比較，*P<0.05

4.ZEB1對子宮內膜間質細胞遷移、侵襲的影響：內膜間質細胞轉染后，空質粒組每高倍視野透膜細胞數為 191±22，ZEB1組每高倍鏡視野下的細胞數為634±91；小室半透膜表面鋪Matrigel膠后，空質粒組間質細胞透膜細胞數為187±21，ZEB1組細胞透膜細胞數為460±38，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。

討 論

轉錄因子ZEB1屬于鋅指同源家族成員，通過其特殊的鋅指結構與下游靶基因啟動子區的E-box序列結合，從而參與一系列重要的生理過程，包括中胚層的發生、神經嵴細胞的發展等[8]。近年來，越來越多的研究發現ZEB1在多種腫瘤中異常表達，并參與腫瘤進展[9]。ZEB1可參與調控細胞極性，抑制基膜的合成，激活基質金屬蛋白酶MMP-1、MMP-9、MMP-14的表達，從而促進基膜的重塑，促進對周圍組織的侵襲[10]。內異癥是婦科良性疾病，但是具有腫瘤侵襲、轉移的惡性生物學行為。有研究發現，在內異癥的發病過程中，上皮細胞間質轉化(EMT)及間質細胞上皮轉化(MET)可能參與的疾病的進展[11]。作為EMT的調控因子，ZEB1在內異癥的發生、發展過程中可能發揮重要作用。

在正常的子宮內膜中，ZEB1的表達僅在內膜肌層以及內膜的間質細胞，且定位于細胞胞核中。在正常子宮內膜的腺上皮細胞中沒有ZEB1的表達。隨著月經周期的變化，分泌期間質細胞中ZEB1的表達顯著高于增生期。此外，在體及體外實驗發現，雌激素及孕激素均可調控間質細胞中ZEB1的表達[12,13]。本研究發現ZEB1在異位內膜間質細胞及腺上皮細胞中顯著高表達，且表達量隨月經周期發生波動，分泌期高于增生期。ZEB1僅在子宮內膜異位病變的上皮細胞中表達，而在正常子宮內膜中不表達，提示ZEB1在內異癥發病機制中可能發揮重要作用。異位內膜上皮具有更高水平的間充質特征，從而導致其侵襲性增強。此外，異位腺上皮細胞間質標記表達增加，且這一變化出現在內膜異位種植以后發生。由此，筆者推測病變不同的微環境，如炎癥、基因異位損傷或其他因素的差異，導致異位種植內膜發生表型的改變[14]。

向原代培養的子宮內膜間質細胞中轉染ZEB1真核表達載體，Western blot法檢測轉染后子宮內膜間質細胞中ZEB1的蛋白表達明顯升高。運用CCK8及Transwell檢測增殖及侵襲情況，結果提示ZEB1的高表達可增強間質細胞的增殖能力、促進細胞的侵襲、遷移能力。正常人子宮內膜隨性激素的改變而發生周期性的脫落，這種周期性的脫落伴隨內膜細胞的凋亡及增殖。內膜細胞凋亡與增殖的平衡有利于維持子宮內膜的正常形態及功能，而細胞凋亡和(或)增殖異常會導致內膜的病理生理過程。Braun等[15]在mRNA水平檢測內異癥患者與正常對照內膜凋亡調節基因的表達，發現內異癥患者的在位內膜DAD-1表達顯著升高，內膜腺上皮細胞及間質細胞Bcl-xl/Bcl-x的比例增加，而caspase-1、p53轉錄豐度的下降，提示內異癥患者存在凋亡調控基因表達異常。有研究發現,miR-200b通過靶向調控ZEB1、ZEB2和KLF4，亦可影響內異癥細胞的增殖、侵襲性和干性[16]。

大量研究表明ZEB1可通過影響P53和RB依賴的抑癌通路，阻止細胞衰老及凋亡。此外，通過抑制周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN1A和INK4B，允許G1～S細胞周期進展，進而調控細胞周期[17]。在前列腺癌中，ZEB1亦可通過激活ERK1/2信號通路，調控腫瘤細胞的增殖及侵襲[18]。miR-590-3p通過靶向作用與ZEB1，調控心臟成纖維細胞的增殖、遷移和膠原合成[19]。ZEB1作為細胞內基本生理過程的關鍵調控因子，參與干細胞分化、細胞增殖與衰老以及存活與凋亡的調控。

綜上所述，有活性的異位內膜表現出黏附、侵襲、血管形成、免疫逃逸等生物學行為是內異癥發病的關鍵。本研究發現內異癥患者異位病灶中ZEB1顯著高表達，且該轉錄因子的異常促進了異位內膜間質細胞的增殖與侵襲。本研究結果為進一步探索內異癥的發病機制提供新的思路，ZEB1可能是內異癥侵襲性或嚴重程度的潛在指標。