頸動脈竇電刺激對野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠的影響

陳 潔 胡志玲 代地林 胡邦望 舒 玲 吳 園 張 艷 包明威

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一種以肺血管重構和肺血管阻力進行性增加為特征的慢性疾病，最后導致右心衰竭和死亡[1]。PAH發病機制復雜，預后極差，其中確診患者3年內死亡風險高達30%[2]。目前有很多藥物可以治療PAH，主要是舒張肺血管，例如磷酸二酯酶5抑制劑西地那非和內皮素受體拮抗劑波生坦等，但是這些藥物仍然不能治愈肺動脈高壓患者，PAH患者的病死率依然很高[1]。

研究已經證實，PAH患者存在交感神經過度激活和迷走神經功能的損害，而且這些因素與PAH患者的運動耐受力和預后密切相關[3, 4]。同時，肺動脈解剖研究表明，肺動脈及左右分支含有豐富的交感、副交感神經纖維，這些神經可以分泌神經遞質與肺血管上相應的受體結合，導致肺血管收縮[5]。早期有研究表明，腎上腺素阻滯劑可以治療PAH，降低肺動脈壓力，改善肺動脈重構和右心室功能[6]。同時，最新研究表明，一種口服乙酰膽堿酯酶抑制劑吡斯的明可以通過興奮迷走神經和提高血漿迷走神經遞質水平，改善PAH大鼠的肺動脈重構和右心衰竭[3]。同時，近年來研究表明，非藥物干預自主神經也可以治療肺動脈高壓，例如肺血管去神經術、腎交感去神經術、頸上神經節橫斷等，這些治療方法可以通過降低交感神經張力從而改善肺動脈重構和右心室功能[7]。因此，筆者認為非藥物干預自主神經是未來治療PAH的一個新的研究方向。

頸動脈竇壓力感受器電刺激(carotid baroreceptor stimulation,CBS)可以精準調節自主神經功能，抑制交感神經張力和增加副交感神經張力[8]。最新臨床研究表明，CBS可以通過提高迷走神經功能改善頑固性心力衰竭患者的心功能，降低患者的N末端腦鈉肽(NT-proBNP)，提高患者的運動耐受力[9]。同時，此前有研究表明，CBS可以改善慢性心力衰竭犬的左心室重構和功能[10]。因此，假設CBS可以起到保護MCT誘導PAH大鼠的作用。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級SD雄性大鼠，體質量為180～220g，購自湖南斯萊克景達實驗有限公司。所有大鼠飼養在SPF環境中，在自由飲食、光照/黑暗時間為12h/12h、溫度22±1℃的環境中喂養。

2.野百合堿誘導肺動脈高壓模型的建立和實驗分組:適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為4個組：①Con-sham組：腹腔注射0.9%NaCl注射液，置入CBS模型，不發放電刺激；②Con-CBS組：腹腔注射0.9% NaCl注射液，置入CBS刺激儀，并發放電刺激；③PAH-sham組：腹腔注射野百合堿(MCT)，置入CBS模型，不發放電刺激；④PAH-CBS組：腹腔注射野百合堿，置入CBS刺激儀，并發放電刺激。適應性喂養1周后，所有大鼠置入CBS 刺激儀或者CBS 模型。術后恢復1周，于第2周末，Con-sham 和Con-CBS組給予一次性腹腔注射0.9%NaCl注射液(60mg/kg)，PAH-sham組和PAH-CBS組給予一次性腹腔注射野百合堿(MCT,60mg/kg, 美國Sigma-Aldrich公司)，同時，Con-CBS組和PAH-CBS組CBS儀器開始發放電刺激，直至第6周末。

3.頸動脈竇電刺激儀的置入：大鼠以45mg/kg戊巴比妥鈉全身麻醉后，于頸部正中切口，分離右側頸動脈竇并用卡夫電極包繞，CBS刺激儀(G3NIX-1010，上海杰升生物科技有限公司)或CBS刺激儀模型埋藏于背部皮下，電極導線經皮下隧道連接于CBS刺激儀或CBS模型。Con-CBS組和PAH-CBS組術后1周發放電刺激，以引起血壓下降最低電壓的10%或者心率下降15%為刺激電壓，刺激頻率設置在10Hz，脈沖寬度1ms，每個周期刺激時間5min，間隔時間1min，持續至實驗結束。

4.大鼠心臟超聲檢測：MCT注射4周后通過異氟烷麻醉大鼠，暴露大鼠左側胸部。采用VINNO6VET型超聲心動儀檢測心功能指標，使用15Hz的大鼠超聲探頭，經胸二維、M型及脈沖波多普勒模式獲取超聲心動圖。據研究報道方法測量各組大鼠的心臟超聲指標[3]。左心室射血分數和左心室短軸縮短率通過M型超聲獲得；肺動脈加速時間、射血時間通過主動脈瓣水平胸骨旁短軸測量右心室流出道的脈沖波多普勒流速剖面獲取，同時獲取右心室流出道內徑；右心室舒張末期前后徑和右心室舒張末期厚度通過胸骨旁短軸圖顯示；通過心尖四腔心切面測量并計算右心室面積變化率。

結 果

1.CBS對PAH大鼠肺動脈加速時間的影響：注射MCT 4周后，大鼠出現呼吸加快，體質量減輕，攝食量減少，腳趾發紺，與Con-sham組比較，PAH-sham組大鼠PAT及PAT/ET顯著減少，肺血流頻譜提示典型的“匕首樣改變”，提示肺動脈高壓模型成功，而CBS可以增加PAH大鼠的PAT及PAT/ET(圖1、圖2)。

圖1 CBS對PAH大鼠肺動脈加速時間及肺動脈加速時間/射血時間的影響A.肺動脈加速時間；B.肺動脈加速時間/射血時間；與Con-sham組比較，#P<0.01;與PAH-sham組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 CBS對PAH大鼠肺動脈多普勒血流頻譜代表圖A.Con-sham組；B.Con-CBS組；C.PAH-sham組；D.PAH-CBS組

2.CBS對PAH大鼠的右心室結構和功能的影響：MCT注射4周后，PAH-sham組大鼠的RVEDT、RVAPDd、RVOTD增加，RVFAC降低，而且CBS干預可以改善PAH大鼠上述指標的惡化(圖3)。

圖3 CBS對PAH大鼠右心室結構和功能的影響A.右心室舒張末期厚度；B.右心室舒張末期前后徑；C.右心室流出道內徑； D.右心室面積變化率；與Con-sham組比較， #P<0.01;與PAH-sham組比較，*P<0.01

3.CBS對PAH大鼠左心室功能的影響：注射MCT 4周后，與Con-sham組比較，PAH-sham組大鼠的左心室射血分數及短軸縮短率無明顯減低或升高，各組之間比較，差異無統計學意義(圖4)。

圖4 CBS對PAH大鼠左心室功能的影響A.左心室射血分數；B.左心室短軸縮短率

討 論

通過心臟超聲評估，本研究證明了CBS可以改善MCT誘導肺動脈高壓大鼠的右心室結構和功能。PAH的發病機制復雜，目前尚不明確，但是不同類型的PAH具有相同的病理生理過程，在疾病的中晚期，肺動脈重構與右心室功能不全是其相同的發病機制[11]。近年來臨床證據表明，交感神經過度激活在PAH的發生、發展過程中起著關鍵作用[7]。早期臨床研究發現,伴右心衰竭的PAH患者存在神經內分泌激活，血漿及肺組織中的去甲腎上腺素升高，其中血漿中去甲腎上腺素水平與肺血管阻力呈正相關，與患者的預估生存率呈負相關[12]。基于交感神經激活在PAH發展過程中的重要作用，干預交感神經也成為未來PAH的治療方向。當前干預交感神經的藥物治療主要是腎上腺素受體阻滯劑。基礎研究表明腎上腺素受體阻滯劑可以減輕肺動脈壓力，改善右心室功能，降低PAH大鼠的死亡率[6]。但是臨床試驗表明，β受體阻滯劑會使患者運動耐受力以及血流動力學指標的惡化，因此，目前指南并沒有推薦PAH患者常規使用β受體阻滯劑治療[7]。

目前使用藥物干預交感神經系統治療PAH仍存在爭議，而非藥物干預交感神經的基礎試驗表現出良好的前景。經胸肺動脈去神經術可以降低血清中的去甲腎上腺素，從而改善右心室的重構和功能，其潛在機制與降低肺動脈周圍的交感神經密度有關[5]。頸交感神經橫斷也可以通過降低交感神經活性，降低PAH大鼠的右心室收縮壓、右心室肥厚指數，提高三尖瓣環收縮位移及心排出量，從而改善右心室功能[13]。這些研究說明非藥物干預交感神經可以改善PAH大鼠的右心室功能。

PAH時，短期交感興奮可以代償增加心排出量，但是長期慢性交感興奮會加重右心室的不良重構，加重PAH的進展。同時，交感神經受到刺激后，交感神經末梢會釋放多種神經激素，這些神經激素與右心室上相應的受體結合，參與肺動脈高壓的發展。同時，還通過超聲評估了MCT及CBS對大鼠左心功能的影響，發現各組之間比較,差異均無統計學意義，筆者更多地關注CBS對PAH大鼠右心室功能的影響。右心室功能與PAH患者的嚴重程度和預后密切相關，臨床研究顯示，右心衰竭是導致PAH患者死亡的重要原因[14，15]。同時，自主神經系統的損害與PAH的右心室功能紊亂密切相關，交感神經激活程度與患者的運動耐受能力呈負相關，是PAH臨床惡化的一個重要預測因子[3，4]。CBS可以降低交感神經張力，增加迷走神經張力，筆者先前的研究也表明CBS可以通過調節離子通道和自主神經重構進而抑制室性心律失常[16]。

PAH時，肺動脈血流超聲頻譜表現為，收縮早期加速，加速后陡峭上升，PAT明顯縮短，與MCT誘導PAH大鼠的肺血流頻譜結果一致，也呈現典型的“匕首樣”改變。由于條件限制，本研究暫時不能獲取肺動脈收縮壓、三尖瓣和肺動脈瓣反流速度等直接反映肺循環血流的指標，因此筆者通過測量肺動脈加速時間來間接評估肺動脈壓力。有研究表明PAT越短，提示肺血管阻力和肺動脈壓力越高[17]。本研究也表明，PAH大鼠的肺血流頻譜PAT明顯變短，而CBS可以提升PAH壓大鼠的PAT，提供了CBS可以降低PAH大鼠的肺動脈壓力的間接證據。同時，CBS可以降低右心室舒張末期厚度及右心室舒張末期前后徑，說明CBS可以改善PAH大鼠的右心室肥厚以及降低右心室容積。一項臨床研究顯示，RVFAC不僅能夠反映右心室的收縮功能，而且RVFAC與右心室射血分數呈正相關，比起三尖瓣環收縮位移更能反映肺動脈患者的血流動力學的嚴重程度[18]。CBS可以降低MCT誘導肺動脈高壓大鼠的RVFAC，說明CBS不僅可以提高MCT誘導PAH大鼠的收縮功能，而且再次為CBS降低PAH大鼠的血流動力學參數提供了間接證據。因此，筆者推測CBS可能可以通過調節自主神經功能，在一定程度上降低肺動脈壓力，并改善右心室的結構和功能，從而起到保護MCT誘導PAH大鼠的作用。

綜上所述，筆者通過檢測MCT誘導PAH大鼠的肺血流及右心室心臟超聲，發現CBS可以改善MCT誘導PAH大鼠的右心室功能，其機制可能與降低肺動脈壓力和調節自主神經的平衡有關。這一研究為早期干預和治療PAH提供了新的方案。本研究中應用MCT誘導PAH大鼠模型，這一定程度模擬了臨床上的特發性肺動脈高壓類型，但CBS對于其他類型的PAH是否有效仍需進一步研究。此外，CBS對PAH大鼠的治療作用與自主神經之間的相互作用關系以及其具體分子機制尚需進一步探討。