超聲超分辨率微血流成像研究進(jìn)展

鐘傳鈺，鄭元義

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200233)

人體毛細(xì)血管直徑小于10 μm[1]，而數(shù)量極其龐大；微血管改變可作為診斷疾病和評(píng)價(jià)預(yù)后的有效指標(biāo)，但目前肉眼無(wú)法識(shí)別小于100 μm血管所形成的微循環(huán)[1]。MRI、CT、核素顯像和超聲的分辨率僅為亞毫米或毫米級(jí)。超聲超分辨率微血流成像(ultrasound super-resolution microcirculation imaging, USRmi)為解決相關(guān)問(wèn)題帶來(lái)了希望。本文就USRmi起源、超聲定位顯微鏡具體操作步驟及其臨床前應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 USRmi起源

超聲超分辨率成像提出于20世紀(jì)80年代[2]，以分離來(lái)自比經(jīng)典衍射極限更接近源的回波。超聲成像的分辨率極限與波長(zhǎng)有關(guān)，波長(zhǎng)減小則超聲波吸收顯著增加，波長(zhǎng)過(guò)短會(huì)對(duì)成像深度構(gòu)成限制，故臨床超聲成像分辨率的極限為百微米[3]。2006年，熒光光激活定位顯微鏡(fluorescence photoactivated localization microscopy, FPALM)、光激活定位顯微鏡(photoactivated localization microscopy, PALM)和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)等新技術(shù)的出現(xiàn)打破了光學(xué)衍射極限[4-6]；受其啟發(fā)，超聲超分辨率成像的基本思想是基于系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function, PSF)定位每個(gè)隨機(jī)閃爍的熒光源的質(zhì)心，其位置信息堆疊于快速相機(jī)捕獲的實(shí)質(zhì)性順序數(shù)據(jù)集上，形成以亞波長(zhǎng)分辨率實(shí)現(xiàn)空間分辨率的圖像，由此實(shí)現(xiàn)數(shù)十納米的空間分辨率。ZHENG等[7]于2009年提出以超聲造影(contrast enhanced ultrasound, CEUS)測(cè)量小血管內(nèi)流速，采用諧波超聲成像技術(shù)跟蹤超聲微泡在高幀頻下的運(yùn)動(dòng)，后經(jīng)不斷改進(jìn)而形成超聲定位顯微鏡(ultrasound localization microscopy, ULM)技術(shù)，通過(guò)順序觀察不同微泡，可避免微泡之間的干擾，于每幀圖像中檢出孤立的源；已知射頻通道數(shù)據(jù)或波束形成圖像的PSF時(shí)，可對(duì)微泡進(jìn)行微測(cè)量精度定位，并通過(guò)積累亞波長(zhǎng)定位而生成超分辨率微血管圖。

2012年，ROY等[8]嘗試針對(duì)超聲微泡直接及以多普勒角度獨(dú)立測(cè)量小血管內(nèi)血流速度，利用諧波超聲成像跟蹤微泡運(yùn)動(dòng)，并計(jì)算在體兔耳中心動(dòng)脈平均流速。SIEPMANN等[9]采用上述方法檢測(cè)在體質(zhì)心，以改善稀微氣泡最大強(qiáng)度投影技術(shù)。至2013年，ULM已可區(qū)分體外兩支相距小于半個(gè)波長(zhǎng)的血管[10]。之后出現(xiàn)了1.5D陣列[11]和半球陣列[12]兩種三維超分辨率方法，成功將超分辨率成像應(yīng)用于小鼠耳部模型[13]和大鼠大腦模型[3]。

2 ULM技術(shù)步驟

圖1所示為不同ULM技術(shù)的共同基礎(chǔ)[1]。

圖1[1] USRmi處理步驟 (Acquisition：獲取；Detection：檢測(cè)；Isolation：分離； Localization：定位；Tracking：追蹤；Mapping：映射)

2.1 導(dǎo)入微泡 目前超分辨率定位單個(gè)微泡均涉及造影劑導(dǎo)入途徑[1]?；径ㄎ环椒ㄒ笪⑴轁舛茸銐虻停员阍谔幚砗鬄V波后利用圖像系統(tǒng)衍射的有限PSF實(shí)現(xiàn)氣泡空間分離；基于稀疏的方法[14]和基于深度學(xué)習(xí)(deep learning， DL)方法[15-16]可滿(mǎn)足上述要求，并允許較高濃度。

2.2 采集錄像 將B模式超聲脈沖發(fā)射到含有微泡的介質(zhì)中后，以常規(guī)或超快幀速率獲取微泡流錄像，并收集基于每個(gè)通道射頻數(shù)據(jù)的矩陣或波束形成的圖像數(shù)據(jù)[1]。

2.3 運(yùn)動(dòng)校正 通常針對(duì)最小血管采集長(zhǎng)錄像。超分辨率圖像由疊加局部變化而產(chǎn)生，幀的運(yùn)動(dòng)顯著影響其可視化，且臨床面對(duì)的運(yùn)動(dòng)尺度常常較大，故運(yùn)動(dòng)校正至關(guān)重要。

2.4 檢測(cè)微泡 區(qū)分微泡與周?chē)M織為關(guān)鍵步驟之一，為后續(xù)定位提供候選區(qū)域，以便最終繪制圖像；檢測(cè)不足意味著定位困難[1]。錯(cuò)誤信號(hào)過(guò)多給后續(xù)濾波過(guò)程帶來(lái)挑戰(zhàn)，為圖像噪聲來(lái)源。一般根據(jù)所用頻率選擇提取微泡信號(hào)技術(shù)，而頻率則取決于成像深度。較高頻率下微泡諧振性差、散射諧波小，故基于微泡運(yùn)動(dòng)或破壞的技術(shù)更為可取。DL技術(shù)亦可用于分離微泡與組織[17]。非線性技術(shù)有利于接近共振，可采用脈沖反演和振幅調(diào)制方法提取微泡信號(hào)。

2.5 微泡分離 濾波步驟可用于識(shí)別每幀圖像中的孤立微泡[2]。圖像中來(lái)自不同微泡的回聲相互干擾，可致定位不準(zhǔn)確，在當(dāng)前階段或跟蹤階段應(yīng)予排斥，且每幀圖像僅能檢出有限數(shù)量的微泡，以免重疊。血液中微泡濃度相對(duì)較高時(shí)，可通過(guò)限制每幀檢出微泡數(shù)量而實(shí)現(xiàn)信號(hào)分離。DESAILLY等[11]以成對(duì)幀減實(shí)現(xiàn)超快成像幀速率，通過(guò)檢測(cè)微泡快速運(yùn)動(dòng)或破壞引起的連續(xù)超聲回波之間的去相關(guān)而隔離微泡。破壞微泡不僅限制微泡跟蹤能力，更不利于對(duì)微血管中流動(dòng)微泡的可視化，故不可取。降低血液微泡濃度是實(shí)現(xiàn)孤立信號(hào)的最直接方法；通過(guò)輸注可保持微泡濃度恒定，以盡可能降低信號(hào)重疊。檢測(cè)和分離技術(shù)往往相互交織，以減少每幀可見(jiàn)微泡量。

2.6 定位 定位孤立信號(hào)是ULM技術(shù)的另一關(guān)鍵。超聲波在組織中傳播時(shí)具有相干性，一般由成像系統(tǒng)的PSF定義單個(gè)孤立的點(diǎn)散射體的響應(yīng)。微泡衍射受限圖像來(lái)源于單一的源，估計(jì)其位置時(shí)，允許精度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)衍射極限。實(shí)際工作中，定位精度決定圖像分辨率的極限。定位顯微鏡技術(shù)通過(guò)限制每幀圖像中檢出的源的數(shù)量而避免其響應(yīng)相互干擾，以獲得遠(yuǎn)高于系統(tǒng)衍射極限分辨率的精度，于數(shù)千幀圖像上積累定位流動(dòng)微泡，最終生成超分辨率血管結(jié)構(gòu)圖像。提取和分離組織中單個(gè)微泡時(shí)，微泡信號(hào)的信噪比對(duì)于定位算法的性能至關(guān)重要。選擇較大的微泡群有助于提高單個(gè)微泡的信噪比[18-19]。SONG等[20]以超快平面波成像解決人體超分辨率成像的潛在噪聲問(wèn)題，豐富的時(shí)間和空間信息有利于分離微泡信號(hào)與背景噪聲。

2.7 跟蹤 通過(guò)微泡在兩幀圖像之間的位移可創(chuàng)建速度矢量，詳細(xì)的速度圖可顯示局部血管速度特征。跟蹤局部點(diǎn)可確定微血管中微泡的路徑和速度，極大提高圖像和信息質(zhì)量，并修改其解釋?zhuān)淇臻g分辨率比多普勒更具優(yōu)勢(shì)，且在很大程度上與流動(dòng)位移方向無(wú)關(guān)；其重要優(yōu)點(diǎn)之一是排除了人工微泡，僅保留具有相干路徑的微泡而形成噪聲較低的圖像。目前ULM技術(shù)創(chuàng)建圖像多已不再是簡(jiǎn)單積累微泡的亞波長(zhǎng)位置，可沿軌道各種定位其位移而實(shí)現(xiàn)插值。一些學(xué)者[3，13]嘗試以此建立每個(gè)微泡在微米尺度上的方向和速度?；诳柭?Kalman)濾波器跟蹤微泡能顯著提高跟蹤精度[21]。

2.8 可視化 運(yùn)動(dòng)校正后于微泡位置創(chuàng)建地圖能可視化定位、密度或計(jì)算速度，揭示血管網(wǎng)絡(luò)細(xì)節(jié)，可通過(guò)檢測(cè)反映超分辨率細(xì)節(jié)尺度的像素大小的細(xì)網(wǎng)格中積累的微泡或?qū)⒚看味ㄎ焕L制為高斯分布而實(shí)現(xiàn)，其值反映定位的不確定性。

3 USRmi用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

3.1 癌癥 超聲成像成本低且安全[22]，可作為癌癥的首選影像學(xué)檢查方式。乳腺癌現(xiàn)已成為最常見(jiàn)的癌癥[23]。GHOSH等[24]以USRmi縱向監(jiān)測(cè)小鼠三陰性乳腺癌微血管網(wǎng)絡(luò)變化，發(fā)現(xiàn)靶向治療后腫瘤組織的血管組織比逐漸下降，表明USRmi具有在體監(jiān)測(cè)早期腫瘤對(duì)藥物治療的反應(yīng)的潛力。

傳統(tǒng)灰階或多普勒超聲技術(shù)難以可視化早期腫瘤微血管結(jié)構(gòu)，而高分辨率對(duì)比超聲能檢出血管生成的生物標(biāo)志物[25-27]。2012年，GESSNER等[25]提出一種高分辨率超諧波成像技術(shù)，即聲學(xué)血管造影，能可視化腫瘤相關(guān)微血管異常，并檢測(cè)腫瘤引起的體內(nèi)血管生成相關(guān)形態(tài)異常，但其分辨率受限于成像系統(tǒng)頻率。ULM技術(shù)使USRmi成為潛在的強(qiáng)大工具，可通過(guò)血管生成標(biāo)記識(shí)別惡性腫瘤。LIN等[26]以USRmi觀察大鼠纖維肉瘤的三維微血管模式(圖2)，并與健康組織相對(duì)照，顯示腫瘤血管生成特征，如高度彎曲等，圖像空間分辨率相比傳統(tǒng)聲學(xué)血管造影大幅提升。

圖2[26] 應(yīng)用超分辨率成像三維微血管模式可視化大鼠纖維肉瘤的最大強(qiáng)度投影圖像，顯示健康微血管結(jié)構(gòu)(A、B)和腫瘤相關(guān)微血管(C、D)3D結(jié)構(gòu)

ULM用于臨床應(yīng)超越簡(jiǎn)單描述微血管形態(tài)而允許提取相關(guān)生物標(biāo)志物。2018年，OPACIC等[27]提出運(yùn)動(dòng)模型超聲定位顯微鏡(motion model ultrasound localization microscopy, mULM)作為先進(jìn)跟蹤技術(shù)用于臨床，采用標(biāo)準(zhǔn)幀速率常規(guī)超聲設(shè)備可于不足1分鐘內(nèi)提取超分辨率圖像和新的參數(shù)，準(zhǔn)確識(shí)別不同血管表型腫瘤(圖3)；通過(guò)USRmi可導(dǎo)出其功能參數(shù)，包括相對(duì)血容量、血流方向、血流速度、血管距離和速度，并可區(qū)分不同類(lèi)型腫瘤，有望成為診斷腫瘤和監(jiān)測(cè)治療不可或缺的工具。USRmi重建微血管網(wǎng)絡(luò)精細(xì)結(jié)構(gòu)可幫助診斷惡性腫瘤或區(qū)分不同類(lèi)型腫瘤。

圖3[27] 基于mULM的不同血管表型腫瘤參數(shù)圖 彩色編碼地圖顯示微泡覆蓋檢測(cè)位置，示相對(duì)血容量(A)、單個(gè)微泡速度(B)和微泡血流方向(C)

3.2 神經(jīng)病學(xué) CT血管造影(CT angiography, CTA)和MR血管成像(MR angiography, MRA)為臨床常用腦血管成像方法，其血管解剖成像分辨率為毫米級(jí)，且對(duì)血流動(dòng)力學(xué)不敏感。由于顱骨可致聲束明顯衰減和失真，超聲腦血管成像主要用于新生兒和開(kāi)放顱骨腦手術(shù)[28]。超快超聲成像極大地提高了對(duì)腦血流的敏感性?；诔暡ǖ哪X功能成像以檢測(cè)腦血管容量變化替代腦活動(dòng)，其誕生標(biāo)志著超聲醫(yī)學(xué)已進(jìn)入神經(jīng)成像領(lǐng)域。ERRICO等[3]于2015年以15 MHz超聲波探針穿過(guò)大鼠頭骨，采用超快超聲定位顯微鏡(ultrafast ultrasound localization microscopy, uULM)行大腦微血管成像(圖4)，其分辨率可用于9 μm(1/10λ)的血管，并以150 s掃描時(shí)長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)了平面內(nèi)血流剖面。2018年COUTURE等[29]通過(guò)定位孤立的小于20 μm微泡，跟蹤并積累微泡移動(dòng)位置而生成超分辨率圖像，克服了空間分辨率的衍射極限。

圖4[3] 采用超速掃描儀通過(guò)頭骨骨質(zhì)稀疏部位行大鼠腦血管超分辨率圖像(15 MHz) A.于頭骨較薄處行冠狀位uULM，得到10 μm×8 μm的深度和橫向分辨率； B.來(lái)自A的部分血管的平面內(nèi)速度圖； C.經(jīng)完整頭骨行uULM，獲得12.5 μm×1 μm的深度和橫向分辨率，可檢出最小血管寬度為20 μm； D.來(lái)自C的部分血管的平面內(nèi)速度圖 (箭示血流方向)

迄今為止尚無(wú)任何在體、非侵入性成像技術(shù)可捕獲人腦毫米分辨率以下解剖和功能特征。相比之下，將USRmi動(dòng)物模型成果向臨床轉(zhuǎn)化是更為緊迫的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。2021年DEMENé等[30]靜脈注入微泡，以超快ULM行微米級(jí)分辨率經(jīng)顱深層成像，獲得人腦血管及相應(yīng)量化血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，解決了經(jīng)顱ULM(transcranial ULM, t-ULM)空間分辨率低、顱骨畸變和運(yùn)動(dòng)偽影等主要問(wèn)題，表明這種低超聲波頻率、預(yù)期低信噪比的技術(shù)不僅可在存在運(yùn)動(dòng)的情況下用于成人大腦，且分辨力可達(dá)25 μm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了功能超聲成像的1 mm分辨力；除顯示解剖結(jié)構(gòu)之外，還可表征動(dòng)脈瘤的血流動(dòng)力學(xué)(圖5)。USRmi在神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域具有巨大潛力，可極大提高對(duì)大腦的理解及對(duì)神經(jīng)疾病的監(jiān)測(cè)能力。

圖5[30] t-ULM顯示深部動(dòng)脈瘤 A.右大腦中動(dòng)脈瘤患者傾斜軸向腦切片ULM(獲得24 s)； B、C.與之對(duì)應(yīng)的6 mm(B)、7 mm層厚(C)CTA最大強(qiáng)度投影圖 (綠箭頭示右大腦中動(dòng)脈瘤，藍(lán)箭頭示血管，白框示載瘤區(qū))

3.3 腎臟病學(xué) 2017年FOIRET等[31]將USRmi用于腎臟微血管，以專(zhuān)用高幀率成像序列定位大鼠腎臟內(nèi)單個(gè)微泡，通過(guò)假設(shè)剛性運(yùn)動(dòng)(翻譯和旋轉(zhuǎn))跟蹤器官運(yùn)動(dòng)并加以校正，同時(shí)跟蹤微泡以評(píng)估小血管血流速度，結(jié)果表明該技術(shù)具有改善血管表征的潛力。SONG等[20]在USRmi噪聲方面取得突破，超快成像的豐富時(shí)空信息支持分離微泡信號(hào)與背景噪聲，將非局部手段去噪濾波器用于微泡數(shù)據(jù)時(shí)空域，以保存微泡運(yùn)動(dòng)軌跡，并抑制隨機(jī)背景噪聲。CHEN等[32]應(yīng)用USRmi技術(shù)，以降至32 μm分辨力的成像模式成功識(shí)別腎臟微血管，于缺血-再灌注損傷腎臟觀察到腎纖維化，并發(fā)現(xiàn)腎臟大小、皮層厚度及相對(duì)血容量均與微血管密度顯著下降有關(guān)，提示這項(xiàng)技術(shù)可作為監(jiān)測(cè)進(jìn)行性腎病的有前途的診斷工具。ANDERSEN等[33]以改進(jìn)的臨床超聲儀獲得大鼠腎臟健康血管的高度詳細(xì)的超聲超分辨率圖像(圖6)，顯示不同大鼠微泡數(shù)量的變化，結(jié)果顯示該法可廣泛用于研究腎臟疾病。

圖6[33] 健康大鼠腎微血管的超分辨率圖像 A.致密皮層(CO)微血管網(wǎng)與外髓質(zhì)(OM)和內(nèi)髓質(zhì)(IM)的直小血管之間有明顯的區(qū)別，其向下延伸至乳頭(PA)； B.平均每幀檢測(cè)到117個(gè)微泡的圖像； C.平均每幀檢測(cè)到70個(gè)微泡的圖像； D.MR T1增強(qiáng)圖像

此外，USRmi已用于觀察2型糖尿病小鼠骨骼肌微血管[34]、兔淋巴結(jié)微血管[35]及兔眼部微血管[36]等，未來(lái)將用于動(dòng)物所有器官，最后應(yīng)用于人體。不久的將來(lái)ULM會(huì)成為一種診斷模式，提供深部組織的微觀層面生物信息。

4 總結(jié)

過(guò)去10年中，USRmi主要通過(guò)ULM技術(shù)克服了超聲成像的衍射極限，并用于癌癥、腦及腎臟等領(lǐng)域研究，但其臨床轉(zhuǎn)化仍存在諸多障礙[1]，主要體現(xiàn)在血管流量、時(shí)間分辨率、信噪比及運(yùn)動(dòng)等方面的限制，以及缺乏金標(biāo)準(zhǔn)、探針幾何形狀、后處理算法、血管網(wǎng)絡(luò)及缺乏三維重建等。顯示血管結(jié)構(gòu)需要較長(zhǎng)時(shí)間為其主要缺陷之一，且長(zhǎng)時(shí)間掃描不可避免會(huì)因生理或外部運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致圖像質(zhì)量顯著下降；注入微泡濃度是另一主要問(wèn)題，系統(tǒng)地經(jīng)血管給藥使臨床很難真正控制靶區(qū)微泡濃度。DL或?qū)⒂兄诳朔鲜鎏魬?zhàn)，但尚需進(jìn)一步評(píng)估。相信不久新型超聲掃描儀將可映射整個(gè)器官的三維微血管，使診斷更加精確，并減輕操作者依賴(lài)性。