超聲造影評價小鼠三陰性乳腺癌模型特征及EGFR靶向治療效果

孝夢甦，朱慶莉，趙辰陽，李建初，呂 珂，馮海涼，劉玉琴，牛梓涵，羅焱文，姜玉新*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院超聲醫學科 協和轉化醫學中心，北京 100730；2.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院細胞資源中心，北京 100005)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer， TNBC)指雌激素受體(estrogen receptor， ER)、孕激素受體和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2， HER2)均為陰性的乳腺癌，在乳腺癌中占比約為20%～30%。不同于其他亞型乳腺癌，TNBC侵襲力強、惡性度高、預后差、復發及轉移率高[1]，肺、腦及骨轉移率高，死亡率高，對傳統化學治療相對較不敏感[2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)在TNBC中的表達程度明顯高于其他亞型乳腺癌；約80% TNBC高表達EGFR[3]，而其他亞型中僅10%表達EGFR[4]，使得EGFR成為近年診斷及治療TNBC的重要靶點之一[5-6]。本研究采用超聲造影(contrast enhanced ultrasound， CEUS)動態觀察小鼠TNBC模型不同階段TNBC病灶及新生血管發展情況，評價EGFR通路靶向藥物治療TNBC的效果。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 35只雌性非肥胖糖尿病及嚴重聯合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency， NOD-SCID)小鼠，4～5周齡，體質量16～18 g，購自華阜康生物科技股份有限公司。EGFR通路抑制劑為司美替尼(Selleck公司)，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)選擇性抑制劑為GDC-0941(Selleck公司)，人乳腺癌細胞MDA-MB-231、RPMI1640培養基及胎牛血清由國家實驗細胞資源共享平臺中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心提供。

1.2 構建模型 于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中復蘇MDA-MB-231細胞，置于37℃、5% CO2培養箱內，每4～6天進行傳代；待70%～80% MDA-MB-231細胞匯合度狀態良好時收集細胞并計數，以1×107個細胞/只接種于5只小鼠右側腋窩皮下。接種后33天處死小鼠，獲取腫瘤組織并研磨制成單細胞懸液，以0.9%生理鹽水調整細胞濃度至1×108個/ml；以1×107個/只接種其余30只小鼠左臀部皮下，隨機分為靶向組及對照組各15只，并逐只編號。對靶向組于建模后第3、7、11及15天經腹腔注射聯合藥物(20 nmol司美替尼及20 nmol GDC-0941)，每只0.1 ml；對照組經腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 CEUS 采用Mindray Zonare超聲診斷儀，線陣探頭，頻率18～30 MHz。分別于建模后第5、10、15及20天行超聲檢查，每次隨機檢查5只。由2名具有3年工作經驗的超聲科醫師將凝膠墊置于小鼠腹部與超聲波探頭之間，以灰階超聲測量小鼠左臀部腫瘤體積，并觀察其內部回聲；以CDFI評價并記錄病灶內部及周邊血流信號；顯示病灶最大切面，調節圖像至最佳，切換進入諧波CEUS模式，采用聲諾維(Bracco)加入5 ml生理鹽水溶解，充分振蕩至乳白色，形成微氣泡混懸液，六氟化硫濃度45 μg/ml，以眶后靜脈團注法將0.05 ml造影劑注入小鼠體內，儲存120 s CEUS圖像。根據增強達峰時病灶內造影劑分布將增強模式分為4型[7]：Ⅰ型，周邊呈環狀增強，內部無增強；Ⅱ型，周邊呈環狀增強，并向病灶內穿入；Ⅲ型，呈均勻或不均勻的彌漫性增強；Ⅳ型，周邊呈環狀增強，病灶內部呈結節狀增強，意見存在分歧時經協商達成一致。以Philips SonoLiver軟件繪制時間-強度曲線(time-intensity curve， TIC)，計算CEUS相關參數，包括病灶峰值強度(peak intensity， PI)、達峰時間(time to peak， TTP)及上升時間(rise time， RT)；每名醫師測算3次，取平均值作為結果。

1.4 病理學 每次CEUS檢查后隨機處死每組3～4只小鼠(最后一日全部處死)，切取腫瘤組織，沿CEUS檢查切面剖開腫瘤，于切面側標記腫瘤方向，以10%多聚甲醛溶液固定標本。常規進行HE染色，以免疫組織化學檢測EGFR及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)表達水平；以3D Hishtech Pannoramic 250掃描儀及Image-pro pus 6.0軟件測量光密度(optical density， OD)值。

1.5 統計學分析 采用SPSS 21.0統計分析軟件。以中位數(上下四分位數)表示不符合正態分布的計量資料，組間比較行Mann-WhitneyU檢驗；采用χ2檢驗或Fisher精確概率法比較組間CDFI及CEUS增強模式的差異。以Spearman相關性分析評價CEUS參數與病理學指標的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常規超聲 成功建立30只TNBC小鼠模型，成瘤率100%。建模后第5天，靶向組與對照組腫瘤體積無明顯差異(P>0.05)；建模后第10～20天，靶向組腫瘤體積均明顯小于對照組(P均<0.05)，見表1。

表1 不同時間點小鼠TNBC模型腫瘤體積比較

常規超聲2組腫瘤均表現為邊界清晰的低回聲，內部多較均勻。靶向組7只CDFI 未見血流信號，8只內部或周邊見條形血流信號；對照組3只未見血流信號，12只內部或周邊見條形血流信號。組間小鼠TNBC病灶 CDFI表現差異無統計學意義(P=0.245)。

2.2 CEUS 靶向組Ⅰ型增強1只、Ⅱ型4只、Ⅲ型1只，Ⅳ型9只；對照組Ⅰ型2只、Ⅱ型2只、Ⅲ型2只、Ⅳ型9只；組間小鼠TNBC病灶 CEUS增強模式差異無統計學意義(χ2=1.333，P=0.721)。

建模后第5～20天，靶向組小鼠TNBC病灶PI均顯著低于對照組(P均<0.05)；組間RT、TTP差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表2及圖1、2。

圖1 建模后第10天靶向組小鼠 A.灰階超聲可見邊界清晰的低回聲腫瘤； B.CDFI于腫瘤內部未見明顯血流信號，周邊可見條形血流信號； C.CEUS可見腫瘤周邊呈環狀增強，并向病灶內穿入(Ⅱ型)； D.TIC顯示PI為269%

圖2 建模后第10天對照組 A.灰階超聲可見邊界清晰的低回聲腫瘤； B.CDFI于腫瘤內部未見明顯血流信號； C.CEUS可見腫瘤內部呈不均勻彌漫性增強(Ⅲ型)； D.TIC顯示PI為8 440%

表2 不同時間點小鼠TNBC模型TNBC CEUS參數比較

2.3 病理學 建模后第10～20天，靶向組EGFR均顯著低于對照組(P均<0.05)；建模后第5～20天，靶向組VEGF均顯著低于對照組(P均<0.05)，見表3。

表3 不同時間點小鼠TNBC模型腫瘤EGFR及VEGF OD值比較

2.4 相關性分析 EGFR與VEGF具有相關性(r=0.629，P<0.001)；PI與EGFR及VEGF均具有相關性(r=0.679、0.839，P<0.001)；RT、TTP與EGFR及VEGF均無明顯相關(P均>0.05)。

3 討論

EGFR可促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移[8-9]。TNBC缺失其他亞型乳腺癌所具有的ER和HER2介導的通路，而EGFR通路對于TNBC發病具有至關重要的作用，相比不表達EGFR者，EGFR高表達TNBC患者預后差、轉移率高、生存率低，治療效果差[3]。本研究采用EGFR通路靶向藥物阻斷EGFR信號傳導，以期達到靶向阻斷腫瘤生長和新生血管生成的效果。

本研究以超聲動態觀察TNBC腫瘤生長情況及靶向藥物治療后的生長變化情況，發現初期(建模后第5天)2組腫瘤未見明顯差異，而后期(建模后第10～20天)靶向組腫瘤體積明顯小于對照組，提示靶向藥物對腫瘤具有明顯抑制作用。LIAO等[10]應用攜帶藥物的納米復合物靶向結合TNBC的EGFR，以靶向阻斷EGFR通路，結果顯示其可顯著抑制腫瘤生長；而非TNBC低表達EGFR，EGFR靶向治療對其無明顯效果。上述研究及本研究結果均提示EGFR是治療TNBC的重要靶點。

乳腺癌是典型的血管依賴性腫瘤，新生血管對TNBC的發生發展具有至關重要的作用。EGFR可增強血管生成因子表達，促進血管內皮細胞芽生、增殖。CEUS中將造影劑注入血管內，既可清晰顯示腫瘤血管分布及走行，又能獲得腫瘤血管功能參數，定量評估腫瘤微循環灌注。本研究應用CEUS動態觀察不同階段TNBC的血供變化，發現隨時間延長，TNBC新生血管逐漸增多、PI逐漸增加；靶向阻斷EGFR通路后，PI顯著低于對照組；病理結果顯示，靶向組TNBC的EGFR與VEGF表達均顯著低于對照組。

本研究發現CEUS所測 PI與EGFR、VEGF均具有相關性，其變化趨勢一致；EGFR與VEGF亦相關。EGFR能刺激平滑肌細胞分泌VEGF，進一步促進腫瘤新生血管生成。EGFR介導的信號傳導在血管生成中具有重要作用，阻斷EGFR通路可有效降低VEGF表達，減少TNBC新生血管生成。

綜上所述， CEUS可動態評估小鼠TNBC病灶及血管生成，可視化及量化TNBC生長過程中新生血管的變化，為評估靶向治療TNBC效果提供影像學依據；靶向阻斷EGFR通路可有效縮小TNBC腫瘤體積、降低CEUS PI及EGFR、VEGF表達水平。本研究CEUS采用眶后靜脈注射法，小鼠較難耐受，導致各時間點小鼠樣本量較小，有待進一步完善。