合成生物學在水稻基因工程及遺傳改良中的應用研究進展

王 爽，何 勇，童曉紅，應杰政，田志宏*，王以鋒

（1.長江大學生命科學學院/濕地生態與農業利用教育部工程研究中心/澇漬災害與濕地農業湖北省重點實驗室，湖北荊州 434025；2.中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，浙江杭州 311400）

合成生物學是以系統生物學為研究基礎，利用基因工程和工程學概念人工設計和改造現有的生物系統，以獲得具有新功能生物體系的一門學科。近些年，合成生物學已成為農作物改良的重要手段和焦點領域，在提高農作物產量、增強作物營養品質等方面發揮著重要作用。

水稻是世界重要的主糧之一，它高度自交、花粉壽命短，作為轉基因受體具有生態安全可控的特性。水稻作為合成生物學的載體具有以下明顯優勢：1）水稻易儲存且蛋白不易因變性降解等導致功能損失；2）水稻產量較高，是我國居民的主食，在水稻上進行營養加強是提升全民健康的最便捷方式；3）作為真核生物，水稻具有類似人和動物的加工修飾系統，可以保證下游產物的活性；4）水稻高度自交是轉基因生態安全的重要保證。本文綜述了合成生物學在水稻生物反應器上取得的一系列進展。

1 生物醫藥方面的研究

1.1 人血清白蛋白

人血清白蛋白（Human scrum albumin，HSA）是一種可溶性、球狀和非糖基化的單體蛋白，主要作為類固醇、脂肪酸和甲狀腺激素的載體蛋白，在穩定細胞外液方面起著重要作用。HSA 在臨床上廣泛用于治療嚴重燒傷、失血性休克、低蛋白血癥和肝腹水等，也被用于癌癥和艾滋病的輔助治療［1-2］。在過去的幾十年中，各種表達系統被用來產生HSA，包括大腸桿菌［3］、釀酒酵母［4］、乳桿菌［5］、轉基因動物［6］、轉基因植物［7-8］，雖然在這些系統中成功地表達了HSA，但它們都沒有實現大規模、高效、低成本的目標。Yang 等成功地在水稻種子中表達重組人血清蛋白（rHSA），rHSA 水平達到水稻籽粒總可溶性蛋白的10.58%，大規模生產rHSA 產生的蛋白純度＞99%，生產率為2.75 g·kg-1糙米［9-10］。將得到的OsrHSA 與眾人血漿中提取的血清蛋白（pHSA）進行各項物理指標的對比，發現它們具有高度的一致性。在促進大鼠細胞生長和治療肝硬化方面，OsrHSA 的效率與pHSA 相似。此外，OsrHSA 在體外和體內的免疫原性與pHSA相似。

1.2 人胰島素樣生長因子1

人胰島素樣生長因子1（Human insulin-like growth factors 1，hIGF-1）是一種由70 個氨基酸組成的單鏈小肽，是調節生長、存活和代謝的主要生長因子［11］。臨床上，hIGF-1 用于有效治療生長激素（GH）受體缺乏、GH 不敏感綜合征、hIGF-1 基因缺失或GH 信號轉導通路缺陷的患者［12］。此外，hIGF-1可有效用于治療1 型和2 型糖尿病或嚴重胰島素抵抗綜合癥患者［13］。Xie 等通過轉基因水稻植株在種子中高度積累重組人胰島素樣生長因子1（rhIGF-1），達到種子總蛋白的（6.8±0.5）%［14］，相當于每粒（136±10）μg。功能分析表明，rhIGF-1 的融合作用在體外可刺激人乳腺癌細胞系MCF-7的增殖。動物試驗表明，糖尿病小鼠口服未加工的轉基因種子可顯著提高血漿IGF-1水平，降低血糖。

1.3 纖維素生長因子

纖維素生長因子（Fiber growth factor，FGFs）是一類蛋白質家族，與肝素結合多肽在結構和生物活性上相似。到目前為止，已經分離出23 種不同的FGFs［15］。堿性纖維生長因子（Basic fibroblast growth facto，bFGF）是FGFs 的一種，它是一種單鏈蛋白，能刺激NIH/3T3 細胞的增殖，抑制干細胞的分化，并可能因其體外增殖，遷移和改變人氣道平滑肌細胞收縮表型的能力而在治療哮喘中發揮重要作用［16］；在臨床上，bFGF 廣泛應用于加速傷口愈合，也用于心血管和神經退行性疾病的有效組織修復和傷口愈合等方面［17-18］。An 等成功地在水稻胚乳中表達了重組bFGF，表達水平達到99.11～185.66 mg·kg-1糙米［19］，進一步的研究表明，OsrbFGF 對NIH/3T3 細胞增殖具有相同的刺激作用。純化的FGF 與其他測試產品也具有相同的體內傷口愈合效果。

1.4 乳鐵蛋白

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是80 kDa 鐵結合糖蛋白的轉鐵蛋白家族的一個成員，具有單個多肽鏈和兩個鐵結合結構域，由乳腺、唾液腺和胰腺分泌，在人（1.0～3.0 mg·mL-1）和哺乳動物的初乳中含量最高。LF是一種多功能蛋白，具有多種生物活性，包括抗菌、抗病毒、調節鐵的吸收、調節免疫系統和促進細胞生長等，被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發潛力的食品和飼料添加劑。Nandi 等將一種合成人乳鐵蛋白（HLF）的基因與水稻的glutelin 1啟動子結合轉入水稻中，得到了rHLF 表達水平為4.5～5.5 g·kg-1糙米的轉基因水稻，并且能在水稻中穩定遺傳［20-21］。進一步分析表明，rHLF 與人類HLF 在一系列的生化和生物物理指標高度相同。該產品目前已經商業化，名稱為Lacromin。

1.5 人溶菌酶

人母乳中含有50～400 μg·mL-1溶菌酶（Homan iysozyme，Hlys），這種酶是母乳中最豐富的蛋白質之一，可作為一種具有殺菌作用的天然抗感染物質，在抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加快組織恢復功能等方面具有重要的作用。Huang 等通過利用Gt-1啟動子及其信號肽區域構建了Hlys基因相應的表達載體，轉入水稻中成功表達了rHlys［22］。溶菌酶的表達水平達到糙米重量的0.6%或可溶性蛋白的45%，并能在后代中穩定遺傳。

2 疫苗生產方面的研究

2.1 豬蛔蟲病疫苗

豬蛔蟲病是由于豬蛔蟲寄生在豬體內，導致生豬發育不良，嚴重者發育停滯，甚至造成死亡。該病在世界各地都存在并且相對廣泛，是一種危害養豬業極為嚴重的寄生蟲病，給養殖戶經濟收入造成巨大的壓力。Yasunobu 等在胚乳特異性GluB-1啟動子的控制下，在水稻胚乳中表達As16（Ascaris suum 16，一種豬蛔蟲的保護性抗原）［23］。這種抗原以與霍亂毒素（CT）B 亞單位CTB 的嵌合融合蛋白的形式被生產，表達水平達到50 μg·g-1糙米。進一步實驗表明，將含有As16 的水稻種子喂食小鼠，會引發小鼠體內產生As16特異性的血清抗體免疫應答。雖然疫苗的佐劑配方導致未能繼續提高特異性免疫應答，但重組As16能誘導抗體表達，表明利用水稻胚乳生產該疫苗具有可行性。

2.2 阿爾茨海默病疫苗

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）亦稱老年癡呆癥，是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病，主要導致認識障礙。AD 的發生被認為是由于淀粉樣β 肽（Aβ）沉積在大腦皮層［24］，由于Aβ是一種蛋白質，AD疫苗是潛在的治療或預防手段。Yoshida 等將Aβ 基因與綠色熒光蛋白（GFP）結合后轉到水稻中，得到的轉基因水稻中Aβ-GFP 融合蛋白最高可達400 μg·g-1糙米［25］。通過將含有Aβ-GFP 融合蛋白的糙米喂給小鼠來評價Aβ 水稻的免疫原性，結果發現口服Aβ 米引起小鼠血清抗Aβ 抗體滴度升高，并且煮熟的Aβ 米并不會降低疫苗的有效性，從而允許其作為一種可食用的疫苗使用，因此Aβ 水稻可作為一種有效地預防阿爾茨海默病的疫苗。

3 膳食營養改良方面的研究

植物營養素和微量營養素在人體的營養與健康中起著重要作用，但它們往往在不同主食中表現不同程度的缺乏。此外，一些有利于健康的營養物質也在糧食作物中缺乏。因此，合成生物學對于提高糧食作物的營養健康物質含量具有重要的應用潛力。迄今為止，通過合成生物學的方法已經開發出富含類胡蘿卜素的“黃金大米”［26-27］、富含花青素的“紫晶米”［28］、富含蝦青素的“蝦青米”［29］等。

3.1 富含花青素的“紫晶米”

花青素屬于生物類黃酮物質，而黃酮物質最主要的生理功能是清除自由基和抗氧化能力，可以作為天然色素和營養強化劑應用到食品著色劑、抗衰老化妝品、保健等方面。Zhu 等開發一種高效的轉基因堆積載體系統，并利用該系統構建了一個由胚乳特異性啟動子驅動的8 個花青素相關基因（來自玉米的2 個調控基因和來自錦紫蘇的6個結構基因），加上一個可選擇的標記和一個用于標記切除的基因；將該載體轉入水稻中產生了一種新的“紫色胚乳稻”（紫晶米）；其在胚乳中具有較高的花青素含量和抗氧化活性［28］。該研究為多基因堆積提供了一個高效、通用的工具包，可應用于復雜生物合成途徑，在合成生物學和改善植物農藝性狀方面具有顯著的應用潛力。

3.2 富含類胡蘿卜素的“黃金大米”

類胡蘿卜素（carotenoids）是一類重要的脂溶性植物營養素，動物自身不能合成類胡蘿卜素，故在促進人類營養和健康方面起著重要作用。流行病學研究表明，類胡蘿卜素可以降低多種癌癥、代謝綜合征、肥胖、白內障及黃斑變性等疾病的發病率［30］。Ye 等將來自水仙花的八氫番茄紅素合酶（phytoene synthase，psy）基因和來自細菌中的crtI基因轉入水稻中，成功獲得了在水稻胚乳中類胡蘿卜素含量達到1.6 μg·g-1的“黃金大米”［27］。Paine 等為了提高類胡蘿卜素的含量，將不同植物來源的psy基因在玉米的愈傷組織中表達，發現玉米和水稻的psy基因導致類胡蘿卜素含量最高，胡蘿卜、番茄、胡椒、擬南芥的psy表現為中間功效，水仙花psy表現最低；他們又將玉米、番茄、胡椒、水稻和水仙花psy的cDNAs 轉入水稻，發現在T1代種子種類胡蘿卜素含量最高的是玉米（14 μg·g-1）和水稻（18 μg·g-1），胡椒或番茄psy產生中間的類胡蘿卜素含量，而水仙花psy產生的含量最低（1.2 μg·g-1），這與玉米愈傷中的實驗結果一致［26］。

蝦青素（astaxanthin）是一種紅色酮類化合物，是一種類胡蘿卜素，也是類胡蘿卜素合成的最高級別產物。在自然界，蝦青素具有最強的抗氧化性。蝦青素主要在一些微藻、細菌和酵母中合成，但在大多數高等植物和動物中不合成，因此人類主要從一些海洋食物中獲得蝦青素，如鮭魚、貝類和鱒魚。Zhu 等利用自己開發的TransGene Stacking II（TGS II）將蝦青素合成途徑的sZmpsy1，sPaCrtI，sCrBKT和sHpBHY四個基因轉入水稻中，在水稻胚乳中建立了蝦青素生物合成途徑，使得蝦青素在胚乳中富集，并且具有較高的抗氧化活性［29］。

4 農藝性狀改良方面的研究

據聯合國經濟與社會事務部預測，至2050年，全球人口將增至97億。如果農作物產量依然維持在現有水平，屆時，人類必將面臨嚴重的糧食短缺局面。因此，提高農作物產量、改良農藝性狀就變得尤為重要。植物的產量與光合作用的效率緊密相關，因此，提高農作物的光合作用效率是關鍵。Shen 等將水稻自身的三個基因：OsGLO3（乙醇酸氧化酶）、OsOXO3（草酸氧化酶）和OsCATC（過氧化氫酶）組合在一起成功構建了一條新的光呼吸支路，簡稱GOC 支路；將該支路轉化到水稻（GOC 植物）中，通過這三種酶在葉綠體的作用可以將乙醇酸依次完全氧化成CO2，形成一種類似C4植物的光合CO2濃縮機制；GOC 植物的光合效率、生物量、氮含量和籽粒產量等均得到顯著增強；該研究還發現，GOC 水稻在高光條件下更有優勢［31］。

5 問題與展望

雖然合成生物學在水稻中已經取得一系列重大進展，但是仍然存在諸多困難和挑戰。比如在利用水稻胚乳生產藥用蛋白方面，目前除HIys、LF 和HSA 已在生產中應用外，多存在表達水平低、純化生產成本較高等問題，導致產業化困難。

從分子生物學的角度來看，目前提高水稻胚乳中活性蛋白產量主要的方法在于提高特異性啟動子的啟動效率，以及特異的增強合成活性蛋白的表達積累。

而在合成代謝產物方面，主要問題是了解生物體中的代謝途徑和關鍵調節因子。盡管有越來越多的植物基因組被測序，但由于缺乏有效的基因功能注釋，使得很難確定編碼完全代謝途徑中關鍵酶的基因組成。而且組成的合成代謝產物很可能導致細胞發育和生長異常。同時，代謝途徑容易受到反饋調節等因素的影響。

隨著全球氣候變暖，極端天氣頻繁出現而可能引發的糧食危機，大力發展新的科學技術保障世界糧食安全日趨緊迫。水稻作為世界上主要的糧食作物之一，改良其農藝性狀尤為迫切，目前利用合成生物學原理提高植物的光合效率是當前進一步大幅度提高水稻產量的有效手段。如何改造、優化當前光合作用系統，使得光能利用效率提高進而增加作物產量，仍是需要我們解決的重大問題。相信合成生物學的研究將在提高水稻產量、增強營養品質等方面發揮重要作用。