Erk1/2 和 Akt 介導白藜蘆醇抗 IPEC-J2 細胞氧化的應激凋亡

劉明明，徐兆云，鞏宇紅，金鑫鑫，袁渤雨，王 瑋，5*

(1.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062；2.中國人民武裝警察部隊特種警察學院，北京 100000； 3.南方醫科大學 南方醫院實驗動物研究中心，廣東 廣州 510515； 4.吉林大學 基礎醫學學院，吉林 長春 130021； 5.仲愷農業工程學院 動物科學學院，廣東 廣州 510225)

氧化應激嚴重影響養殖業發展。如果活性氧(ROS)濃度的增加遠遠超過細胞的抗氧化能力，則該生物將處于氧化應激狀態。細胞處于氧化應激狀態時，將會出現DNA序列片段化，細胞皺縮和細胞核固縮等情況[1-2]，從而引起細胞蛋白表達異常，脂質和DNA損傷，細胞功能障礙和細胞凋亡，最終表現出多種疾病發生[3]。腸上皮細胞(IEC)凋亡和增殖之間的平衡對于維持腸屏障功能至關重要。過度的ROS誘導的IEC氧化應激導致腸毒素滲透增加和過敏原滲透增加，最終引發炎癥級聯反應和一系列組織損傷。過氧化氫是ROS的主要分子，調節氧化應激[4]。過氧化氫為有毒的副產物，已被證明可以破壞腸黏膜，引起氧化應激損傷并影響胃腸道屏障功能[5-6]。利用天然抗氧化劑緩解和保護氧化應激損傷具有重要意義。

目前的研究表明白藜蘆醇具有抗氧化特性，已被應用于多種病毒引發的疾病的治療之中，主要用于抵抗氧化損傷，例如肥胖哮喘[7]，妊娠糖尿病[8]，血管衰老[9]和動脈粥樣硬化[10]，幾乎沒有不良副作用。目前，關于白藜蘆醇對豬腸道上皮細胞的保護作用研究很少。以前的研究表明，在IPEC-J2細胞中，白藜蘆醇處理后Erk和Akt通路被激活。本研究旨在探究Erk和Akt通路在白藜蘆醇對細胞凋亡的保護中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系和細胞培養豬小腸上皮細胞系(IPEC-J2)是一種非轉化的腸細胞系，最初來源于新生仔豬的空腸上皮[11]。細胞在添加10%胎牛血清的D-MEM/F-12培養基中生長。

1.2 細胞模型與分組根據先前的研究，過氧化氫和白藜蘆醇的最佳濃度為50 μmol/L。本研究將IPEC-J2細胞分為4組。過氧化氫組用50 μmol/L過氧化氫處理24 h。對照組用含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培養。白藜蘆醇預處理組(白藜蘆醇+過氧化氫組)用50 μmol/L白藜蘆醇預保護1 h后，用 50 μmol/L過氧化氫處理24 h。抑制劑組用U0126/MK2206處理2 h后，暴露于50 μmol/L白藜蘆醇+過氧化氫中24 h。為了確保氧化應激效率，每次試驗前用30%的新原液制備過氧化氫。

1.3 蛋白免疫印跡收集處理過的細胞并按照標準方案進行蛋白免疫印跡檢測[11]。

1.4 細胞內 ROS 測定將細胞接種在96孔板中，給藥作用24 h后使用DCFH-DA探針檢測熒光強度。

1.5 DAPI(4，6-聯脒-2-苯基吲哚)染色分析細胞凋亡培養IPEC-J2細胞，將其與50 μmol/L過氧化氫孵育24 h，固定細胞并將其置于DAPI溶液中，并在黑暗中孵育1 min，結束后觀察細胞。

1.6 DNA 片段測定將細胞接種到 6 孔板中(0.5×106～1×106/孔)，37℃ 下孵育過夜。用化合物處理 12 h后， 按照說明書使用 OMEGA Tissue DNA Kit 提取 DNA。將從含有 0.5%胎牛血清的 D-MEM/F-12 處理 12 h的細胞中所提取的 DNA 用作陽性對照。15 μL DNA 提取物在 80 V 下進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳 1 h。

2 結果

2.1 白藜蘆醇抑制過氧化氫所誘導的 IPEC-J2 細胞凋亡凋亡小體是細胞凋亡的標志。DAPI 染色結果顯示，25，50 μmol/L 白藜蘆醇對 IPEC-J2細胞具有保護作用(圖 1 E，F)，白藜蘆醇顯著抑制過氧化氫誘導的核固縮和凋亡小體的形成。通過流式細胞儀評估細胞凋亡率(圖 1 G)，結果表明，過氧化氫處理組細胞凋亡百分比(21.13±2.62)%，對照組細胞凋亡百分比(2.88±0.60)%，過氧化氫處理組細胞凋亡百分比明顯高于對照組(P<0.05)，白藜蘆醇預處理后的 IPEC-J2 細胞顯著抑制過氧化氫所誘導的細胞凋亡(4.77±0.50)%。因此，白藜蘆醇可以抑制過氧化氫所誘導的 IPEC-J2 細胞凋亡。

A.對照細胞;B.50 μmol/L 過氧化氫處理組;C～F.不同濃度(5，10，25，50 μmol/L)的白藜蘆醇預處理 1 h，然后 50 μmol/L 過氧化氫刺激 24 h,紅色箭頭所指為細胞核中的凋亡小體;G.使用FITC標記的 Annexin V/PI 染色的流式細胞術分析細胞凋亡(n=3)。**表示與對照組相比P<0.01，## 表示與 50 μmol/L 白藜蘆醇預處理組相比P<0.01圖1 DAPI 熒光染色分析和流式細胞術檢測白藜蘆醇對過氧化氫誘導的 IPEC-J2 細胞凋亡的影響

2.2 白藜蘆醇降低 IPEC-J2 細胞中過氧化氫所誘導的 ROS 產生和凋亡相關蛋白表達氧化應激狀態導致細胞中的ROS增加。為了研究白藜蘆醇是否降低了過氧化氫所誘導的 IPEC-J2 細胞的氧化應激水平，使用熒光探針 DCFH-DA 活性氧檢測試劑盒測量 ROS 的產生。結果表明，與對照組相比，過氧化氫組細胞內 ROS 產生明顯增加(P<0.01)， 而 50 μmol/L 白藜蘆醇預處理組可完全逆轉過氧化氫所誘導的 ROS 產生(P<0.01)(圖 2A)。

A.使用熒光探針 DCFH-DA 活性氧檢測試劑盒檢測活性氧的水平;B～F.在不同濃度的白藜蘆醇存在下，通過蛋白質印跡法(n=3)評估每組中 Bcl-2、Bax、BAD 和 Caspase-3 的蛋白表達。與對照組組比較*P<0.05，**P<0.01；與過氧化氫組比較#P<0.05，## P<0.01圖2 白藜蘆醇對 IPEC-J2 細胞中過氧化氫所誘導的 ROS 產生和凋亡相關蛋白表達的影響

由于以上試驗得出白藜蘆醇具有抑制作用，因此接下來將研究其與內源性過程中凋亡相關蛋白之間的相互作用。通過 Western blot 檢測 Bcl-2/Bax 比值的變化，白藜蘆醇預處理或不預處理后 Bad 和 Caspase-3 的表達水平。結果表明，過氧化氫顯著降低了 Bcl-2/Bax 比值，增加了 BAD、Caspase-3 的表達量。但是，白藜蘆醇增加了抗凋亡的 Bcl-2/Bax的比例，降低了由過氧化氫所誘導的促凋亡蛋白 BAD 和 Caspase-3 的表達水平。結果證明，白藜蘆醇通過內源性凋亡途徑抑制細胞凋亡。

2.3 對 Akt 和 Erk 通路的阻滯減弱了白藜蘆醇對 IPEC-J2 細胞的保護作用已有研究表明 IPEC-J2 細胞的 Erk1/2 和 Akt 途徑可以被白藜蘆醇激活。因此接下來研究白藜蘆醇是否通過這兩個途徑發揮其抗凋亡作用。使用 Erk1/2 或 Akt 的特異性抑制劑 U0126 或 MK2206(10 μmol/L)預處理細胞 2 h后進行試驗。DAPI 染色顯示抑制劑處理后，顯著降低了白藜蘆醇對過氧化氫所誘導的 IPEC-J2 細胞的保護作用。DNA 片段化是凋亡的典型特征，用瓊脂糖凝膠電泳檢測不同條件下細胞內的 DNA 樣品。如圖 3F 所示， DNA 階梯分析表明，與對照組(a)相比，過氧化氫增加了 DNA 片段化(b)，而過氧化氫誘導的 DNA 片段化在白藜蘆醇預處理(c)后減弱，U0126(d)和 MK2206(e)預處理后抵消了白藜蘆醇對過氧化氫誘導的 DNA 片段化的保護作用。結果表明,白藜蘆醇通過 Akt 和 Erk1/2 通路發揮抗凋亡作用。

2.4 Akt 和 Erk1/2 通路抑制劑減弱了白藜蘆醇對過氧化氫所誘導的 IPEC-J2 細胞凋亡相關蛋白表達的影響為了研究白藜蘆醇誘導的線粒體凋亡蛋白表達與 Akt 和 Erk1/2 通路活化之間的關 系，采用蛋白質印跡法檢測有無抑制劑存在時 Bcl-2/Bax 比值。結果表明，白藜蘆醇在過氧化氫處理下顯著提高了 Bcl-2/Bax 的比值(圖 4)。同樣，U0126(圖 4A，C)或 MK2206(圖 4B，D)預處理后消除了白藜蘆醇的保護作用。結果表明，白藜蘆醇通過 Akt 和 Erk1/2 信號通路保護過氧化氫誘導的細胞凋亡。

A.對照組細胞；B.50 μmol/L 過氧化氫處理 組;C.50 μmol/L 白藜蘆醇預處理 1 h后，50 μmol/L 過氧化氫刺激的 IPEC-J2 細胞處理 24 h;D,E.使用 10 μmol/L MK2206和 U0126預處理 2 h,然后用 50 μmol/L 白藜蘆醇處理細胞 1 h，最后加入 50 μmol/L 過氧化氫刺激 IPEC-J2 細胞 24 h;F.對 IPEC-J2 細胞基因組 DNA 進行不同處理的瓊脂糖凝膠電泳分析;(M.DNA Marker；a.對照組；b.50 μmol/L過氧化氫處理組；c.50 μmol/L白藜蘆醇+50 μmol/L 過氧化氫處理組；d.10 μmol/L U0126+50 μmol/L白藜蘆醇+50 μmol/L 過氧化氫；e.10 μmol/L MK2206+50 μmol/L 白藜蘆醇+50 μmol/L 過氧化氫)圖3 白藜蘆醇對過氧化氫誘導的 IPEC-J2 細胞凋亡小體形成和 DNA 斷裂的影響，通過 DAPI 熒光染色分析和 DNA 梯狀瓊 脂糖凝膠電泳檢測到 Erk1/2 或 Akt 通路的特異性阻斷

3 討論

IPEC-J2 是豬的空腸上皮細胞系，廣泛用于豬的腸道通透性和炎癥研究，但關于白藜蘆醇與 IPEC-J2 細胞凋亡之間的研究甚少，具體機制尚不清楚。

氧化應激在許多疾病過程中起著重要作用，這些疾病可引起胃腸道吸收不良和炎癥反應， 例如腹瀉[12-13]、壞死性小腸結腸炎和 IBD[14]。氧化應激的主要原因是 ROS 的過量產生，但是導致細胞凋亡的潛在機制很復雜，涉及多種細胞成分、受體、信號轉導途徑的激活和功能障礙以及 DNA 損傷。ROS 作為主要自由基分子，過氧化氫可以直接導致 ROS的過量產生并誘導許多細胞凋亡。大量研究表明，過氧化氫可在許多細胞類型中誘導氧化應激，例如鼠心肌細胞系 H9C2[15]、人臍靜脈內皮細胞[16]、人肝上皮細胞[17]和人晶狀體上皮細胞[18]。因此，通過增加抗氧化劑酶水平或使用抗氧化劑抑制 ROS 產生或增加 ROS 清除是減少細胞損傷的有效措施[19]。

A,C.U0126抑制機組；B,C.MK2206抑制機組。* P<0.05，**P<0.01圖4 白藜蘆醇在 Erk1/2 或 Akt 通路特異性阻斷后對過氧化氫誘導的 IPEC-J2 細胞凋亡相關蛋白 Bcl-2 和 Bax 的影響

白藜蘆醇作為一種天然多酚，可以有效清除自由基并發揮抗氧化作用[20]。它也作用于人體中的抗衰老酶，進而在預防各種與年齡有關的疾病和延長預期壽命中發揮潛在作用[21-22]。

本研究以 IPEC-J2 細胞為基礎，使用過氧化氫建立氧化應激誘導的細胞凋亡模型。通過白藜蘆醇預處理來研究白藜蘆醇對過氧化氫誘導的IPEC-J2 細胞凋亡的影響。根據我們以前的研究，我們確定了過氧化氫和白藜蘆醇的最佳工作濃度。細胞內 ROS 的測定結果表明50 μmol/L 白藜蘆醇可以減少由過氧化氫誘導的 ROS 的過量產生。DAPI 熒光染色的結果表明50 μmol/L 的過氧化氫可使細胞核固縮，染色質積聚并產生凋亡，而50 μmol/L 的白藜蘆醇可明顯逆轉這種現象。此外，白藜蘆醇可以顯著逆轉過氧化氫誘導的 Bcl-2/Bax 比值降低和促凋亡蛋白 BAD 的表達增加。這些試驗結果充分證明了天然多酚化合物白藜蘆醇可以保護豬的空腸上皮細胞免受氧化應激損傷，也為研究和治療人畜氧化應激相關疾病提供了理論基礎。

進一步的試驗結果表明，白藜蘆醇對 IPEC-J2 細胞的保護作用與 Erk1/2 和 Akt 通路密切相關。大量研究表明，白藜蘆醇可以有效減少多種刺激引起的 ROS 的產生，抑制炎癥的發展，并促進多種抗氧化酶在細胞中的表達[23-24]。其中，NF-κB 是 ROS 敏感的轉錄因子之一，在氧化應激和炎癥反應中起著重要作用，并在抗炎、促進細胞生長和白藜蘆醇的抗癌作用中發揮重要作用[25]。而 MAPKs 家族，包括 JNK1/2、P38/MAPK 和 Erk1/2，是 ROS 的另一個敏感調節因子[26]。白藜蘆醇可以通過減少 Erk1/2 磷酸化和 NF-κB 活性來減輕大鼠氧化應激引起的頸動脈球囊損傷[27]。白藜蘆醇可以通過減弱人血管內皮細胞中的 P38/MAPK 磷酸化來抑制高血糖[27]。白藜蘆醇可以通過激活 Akt 通路改善 2 型糖尿病患者的胰島素抵抗并降低氧化應激[28]。研究表明，白藜蘆醇可以通過減少抗氧化酶 SOD、過氧化氫酶和 HO-1 的表達來抑制過氧化氫誘導的人晶狀體上皮 B-3 細胞的氧化損傷[29]。同樣，Sirt1 在氧化應激反應中也起重要作用。白藜蘆醇通過激活 NAD+依賴性蛋白脫乙酰基酶 Sirt1 來實現其抗氧化作用。反過來，Sirt1 通過誘導線粒體 SOD 發揮細胞內抗氧化作用[30]。在成骨細胞中，過氧化氫可以增加 Bax 和 Caspase-9 的表達以及 P53 的磷酸化，同時下調 Sirt1 的表達。盡管如此，白藜蘆醇可以通過增加 Sirt1 表達來抑制過氧化氫誘導的成骨細胞凋亡[31]。 總之，白藜蘆醇通過多種信號途徑顯示了不同細胞類型中氧化損傷和細胞凋亡的保護作用。 在這項研究中，我們表明Erk1/2和Akt的抑制劑U0126和MK2206減弱了白藜蘆醇對IPEC-J2細胞凋亡的保護作用。這證明白藜蘆醇通過Akt和Erk1/2途徑在豬腸上皮細胞 中發揮其保護作用。

綜上所述，本研究的結果提供了初步證據，表明白藜蘆醇通過減少氧化損傷，維持正常細胞形態和抑制細胞凋亡對 IPEC-J2 具有起到保護作用。此外，白藜蘆醇作用的發揮可能與 Akt 和 Erk1/2 信號通路相關。這些數據共同證明白藜蘆醇可作為維持仔豬腸道健康和屏障完整性的天然化合物的候選者。