不同蛋白水平日糧對(duì)小尾寒羊羔羊瘤胃真菌群落多樣性與結(jié)構(gòu)的影響

李海琴 ,賈建磊*,侯生珍 ,魏 濤

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016;2.山東省煙臺(tái)市蓬萊市畜牧獸醫(yī)站，山東 蓬萊 265699)

反芻動(dòng)物的瘤胃內(nèi)棲居著大量的微生物(包括細(xì)菌、原蟲(chóng)和真菌)[1]，當(dāng)飼料蛋白質(zhì)進(jìn)入瘤胃后,微生物在降解飼料蛋白質(zhì)的同時(shí)，在飼料發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、能量(ATP) 和部分寡肽、氨基酸和氨以及內(nèi)源性的氨能合成微生物蛋白，這些微生物蛋白連同飼料非降解蛋白(包括瘤胃中完整蛋白和部分小肽)隨食糜流動(dòng)進(jìn)入真胃和小腸，被動(dòng)物分泌的消化酶分解成小肽或游離氨基酸，供動(dòng)物機(jī)體利用[2]。

羔羊瘤胃的發(fā)育處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，瘤胃微生物菌群的變化受到羔羊日齡、飼料種類、營(yíng)養(yǎng)水平、飼養(yǎng)管理等多種因素的影響[3]。在羔羊初生時(shí)，羔羊不具備反芻功能，瘤胃內(nèi)微生物會(huì)由母羊產(chǎn)道、哺乳或者外界環(huán)境等進(jìn)入羔羊瘤胃內(nèi)，此后羔羊的飲食結(jié)構(gòu)由母乳逐漸過(guò)渡到固體飼料，瘤胃內(nèi)微生物組成會(huì)隨之改變，微生物的功能也可能發(fā)生改變[4]。有研究表明，隨日糧蛋白(CP)水平的升高試驗(yàn)動(dòng)物瘤胃液中有關(guān)纖維分解的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌數(shù)量顯著升高[5]；瘤胃液氨態(tài)氮的濃度則能夠反映日糧粗蛋白在瘤胃中的降解情況及微生物蛋白的合成情況,粗蛋白的含量變化會(huì)影響提供給反芻動(dòng)物氮源的多少,進(jìn)而影響瘤胃微生物的組成以及數(shù)量的多少[6]。

早期斷奶羔羊的飼養(yǎng)管理，是規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)提高生產(chǎn)效益的關(guān)鍵。本試驗(yàn)選擇 50日齡斷奶的小尾 寒羊雙胎羔羊，飼喂不同蛋白水平的日糧，通過(guò)研究蛋白水平對(duì)瘤胃真菌結(jié)構(gòu)和多樣性的影響,為羔羊的規(guī)模化管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為提高羔羊生產(chǎn)效率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇初始體質(zhì)量(3.17±0.52) kg、體況、胎次相近的青海省海東地區(qū)小尾寒羊雙胎羔羊 120 只，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，于 50 日齡斷奶，隨機(jī)分為 3 組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，每組 40 只；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3組能量水平相同均為 12.00 MJ/kg[7]，蛋白水平依次為 12%，14%，16%，日糧配方見(jiàn)表 1。

表1 羔羊日糧組成和及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

1.2 飼養(yǎng)管理所有試驗(yàn)動(dòng)物從出生后 7 日齡開(kāi)始飼喂開(kāi)食料，飼料(精飼料)營(yíng)養(yǎng)水平同 14%蛋白水平組。所有羔羊于 50 日齡斷奶后分別飼喂蛋白水平為 12%,14%,16%的日糧。本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)整精飼料中原料比例來(lái)調(diào)整蛋白水平，所有羔羊每日飼喂量相同，每 5 d按比例增加飼喂量(精飼料∶青貯米玉∶燕麥干草=7∶2∶1，干物質(zhì)計(jì)算)，其中精料每次每只羔羊增加 15.13 g。3組羔羊 50～90 日 齡每日每只每次飼喂量見(jiàn)表 2；每日飼喂 2 次(8:00 和 17:00)，自由飲水。羔羊進(jìn)圈舍之前對(duì)圈舍進(jìn) 行徹底消毒，此后，每日對(duì)羔羊圈舍進(jìn)行清掃處理。對(duì)各組試驗(yàn)羔羊進(jìn)行常規(guī)的免疫注射及內(nèi)外寄生 蟲(chóng)防治。

表2 羔羊日糧飼喂量(干物質(zhì)基礎(chǔ)) g/d

1.3 樣品采集及分析

1.3.1試驗(yàn)樣品的采集 所有羔羊于 50 日齡斷奶稱體質(zhì)量，羔羊飼養(yǎng)至 90 日齡后，每組隨機(jī)選擇 6 只羔羊，早上空腹稱體質(zhì)量后，頸動(dòng)脈放血屠宰，解剖，取出瘤胃內(nèi)容物用勻漿機(jī)混勻，取上層液體4層紗布過(guò)濾，將濾液裝于 5 mL 凍存管中，液氮帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃冷凍保存，用于后期瘤胃細(xì)菌多樣性的測(cè)定。

1.3.2樣品分析方法 日糧配方中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)、磷(P)、粗脂肪(EE) 測(cè)定分別按照 GB/T 6435-2006、GB/T 6432-1994、GB/T 20806-2006、ISO13906-2008、GB/T6436-2002、GB/T 6437-2002、GB/T 6433-2006 的方法測(cè)定。

消化能計(jì)算公式為[8]DE(MJ/kg)=0.209×CP%+0.322×EE%+0.084×CF%+0.002×NFE%2+0.046×NFE%-0.627瘤胃真菌的測(cè)序工作外包給百邁克生物公司(北京，中國(guó))。每組選擇 6 只試驗(yàn)動(dòng)物，提取 DNA后根據(jù)真菌 18S rDNA 基因的 ITS1 區(qū)域通用引物序列ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)。建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用 Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析根據(jù)UCLUST[9]的方法,對(duì) Tags 在 97%的相似度水平下的優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行操作分類單元(op-eration taxonomic units,OTUs)聚類分析,并過(guò)濾 OTUs(0.005% 作為閾值),篩選出OTUs 的代表性序列。將 OTU 的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可得到每個(gè) OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表[10]，再利用 R 語(yǔ)言工具繪制 OTU-Venn 圖，同時(shí)對(duì)微生物群落進(jìn)行 Unifrac 分析，判斷不同樣品在遺傳學(xué)上距離的遠(yuǎn)近，比較樣品間的差異。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò) Excel 2013 進(jìn)行初步整理，應(yīng)用 SAS 9.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 蛋白水平對(duì)羔羊日增體質(zhì)量的影響從圖 1 中可知，在蛋白水平為 14%(Ⅱ組)90 d 體質(zhì)量最高，但3組差異不顯著，從圖 2 中可知，蛋白水平對(duì)羔羊日增體質(zhì)量影響顯著，Ⅱ組羔羊日增體質(zhì)量顯著高于其他組(P<0.05),Ⅰ與Ⅱ組間差異不顯著。

注：不同小寫(xiě)字母間表示差異顯著(P<0.05)。下同圖2 不同蛋白水平羔羊日增體質(zhì)量

圖1 不同蛋白水平羔羊 50 d 斷奶體質(zhì)量和90 d體質(zhì)量

2.2 蛋白水平對(duì)瘤胃真菌 OTUs 的影響基于97%的物種相似性下所有樣本中共有278個(gè)OUTs，其中有213個(gè)為3組共有OTUs，圖3中Good'scoverage(覆蓋率)大于0.99，本試驗(yàn)測(cè)序深度能夠準(zhǔn)確反映羔羊瘤胃細(xì)菌的組成；3組羔羊中Ⅱ組瘤胃微生物(細(xì)菌)豐富性和多樣性優(yōu)于其他蛋白水平組。利用UniFracPCA對(duì)飼喂不同蛋白水平日糧的羔羊瘤胃中細(xì)菌群落差異進(jìn)行研究，PCA運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，兩個(gè)樣品間的距離越接近，則樣品的組成相越似性。從圖4可知，飼喂不同蛋白水平羔羊瘤胃液樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，彼此間可以很好地分隔開(kāi)，采食相同日糧的樣品可以很好地聚在一起，菌群相似度很高。

圖3 不同蛋白水平羔羊瘤胃液真菌 Venn 圖

圖4 Unifrac加權(quán)主坐標(biāo)分析圖

2.3 Alpha 多樣性分析Alpha多樣性(Alpha diversity)反映的是單個(gè)樣品物種豐度多樣性；Chao1 和Ace 指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少,Shannon 和 Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性，Shannon 指數(shù)值越大，Simpson 指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。從表 4 中可知,不同蛋白水平對(duì)瘤胃菌群的豐富度的影響差異不顯著(P>0.05),多樣性指數(shù)中，Ⅱ、Ⅲ組 Shannon 指數(shù)顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，Simpson指數(shù)Ⅱ、Ⅲ組顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組間Shannon和Simpson指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。

表4 樣品多樣性指數(shù)

2.4 瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)差異變化分析

2.4.1門(mén)水平 從表5中可知，羔羊瘤胃液在門(mén)水平共檢測(cè)出 5個(gè)菌門(mén)，其中子囊菌門(mén)(Ascomycota)是3組羔羊瘤胃液優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。Ⅰ組 Ascomycota 豐度顯著高于其他2組(P<0.05)； 擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota) Ⅱ、 Ⅲ 組豐度顯著高于Ⅰ組 (P<0.05 )；新麗鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota)、毛霉門(mén)(Mucoromycota)、絲足蟲(chóng)門(mén)(Cercozoa)，3組間差異不顯著(P>0.05)。

表5 瘤胃真菌菌群在門(mén)水平物種豐度表 %

2.4.2屬水平 3組羔羊?qū)偎截S度前 10 的真菌見(jiàn)表 6，由表知青霉屬(Penicillium)為本試驗(yàn)優(yōu)勢(shì)菌，PenicilliumⅠ、Ⅱ組豐度顯著高于Ⅲ組(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ組間差異不顯著(P>0.05)；德巴利酵母屬(Debaryomyces)Ⅰ組豐度顯著高于其他2組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著(P>0.05)；帚枝霉屬(Sarocladium)、曲霉屬(Aspergillus)Ⅱ、Ⅲ組豐度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著(P>0.05)；麥角菌屬(Claviceps)Ⅲ組豐度顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ組間差異不顯著；節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)Ⅱ組豐度顯著高于Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ組間差異不顯著(P>0.05)。

表6 瘤胃真菌菌群在屬水平物種豐度表

3 討論

3.1 日糧蛋白水平對(duì)羔羊瘤胃真菌多樣性的影響早期斷奶羔羊瘤胃的發(fā)育還不完善，斷奶后的羔羊所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全部由日糧提供，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)對(duì)羔羊的生長(zhǎng)發(fā)育起到了很大的作用[11]。日糧蛋白水平的不同造成的最直觀結(jié)果是影響羔羊?qū)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用造成生長(zhǎng)速度的不同[12]。本試驗(yàn)中Ⅱ組羔羊日增體質(zhì)量顯著高于Ⅰ組與Ⅲ組差異不顯著。羔羊瘤胃內(nèi)微生物的數(shù)量的變化受多種因素的影響，其中日糧變化是最重要的因素之一，且日糧蛋白質(zhì)水平的影響大于能量水平[13]。本試驗(yàn)3組羔羊瘤胃液真菌，在基于 97%的物種相似性下所有樣本中共有 278 個(gè) OTUs，3組共有 OTUs 213 個(gè),Ⅱ、Ⅲ 組特有OTUs 高于Ⅰ組。Alpha 多樣性分析結(jié)果中，蛋白水平的不同對(duì)羔羊瘤胃真菌豐富度影響不顯著；多樣性指數(shù)中Ⅱ、Ⅲ組Shannon指數(shù)顯著高于Ⅰ組。Simpson指數(shù)Ⅱ、Ⅲ組顯著低于Ⅰ組.Shannon指數(shù)值越大，Simpson 指數(shù)值越小，樣品的物種多樣性越高,Ⅰ組(蛋白水平為 12%)微生物的多樣性較小。郭凱等[14]在不同蛋白水平對(duì)犢牛瘤胃微生物多樣性的研究結(jié)果中表明，高蛋白水平組的多樣性指數(shù)要優(yōu)于低蛋白水平。在本試驗(yàn)中日糧蛋白水平的不同影響了羔羊瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)變化，Ⅱ組、Ⅲ組，瘤胃內(nèi)真菌的多樣性顯著高于Ⅰ組，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著。

3.2 日糧蛋白水平對(duì)羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，在門(mén)水平下3組羔羊瘤胃液共檢測(cè)出5個(gè)菌門(mén)。Ascomycota是3組羔羊優(yōu)勢(shì)菌，豐度均在 70%以上，而Ⅰ組 Ascomycota豐度達(dá)到 96%，顯著高于其他2組，Ⅰ組菌群幾乎集中在Ascomycota下。其余菌門(mén)中 BasidiomycotaⅡ、Ⅲ組豐度達(dá)到 4%以上顯著高于Ⅰ組，Ⅰ組豐度為 1.28%；Neocallimastigomycota、Mucoromycota、 Cercozoa，3組間差異不顯著且豐度均低于1%。在屬水平下豐度前10的真菌中Penicillium是3組優(yōu)勢(shì)菌，3組豐度均達(dá)到15%以上。Ⅰ組屬水平下的菌群多集中在隸屬于Ascomycota的Penicillium、Debaryomyces，其豐度分別達(dá)到了 20%和 50%以上，顯著高于Ⅲ組，Penicillium豐度Ⅰ組與Ⅱ組差異不顯著。Ⅱ、Ⅲ組菌群除在優(yōu)勢(shì)屬Penicillium的豐度達(dá)到 15%以上外，在其余屬上Sarocladium、AspergillusⅡ、Ⅲ組豐度顯著高于Ⅰ組，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著；ClavicepsⅢ組豐度最高，WallemiaⅡ組豐度最高，Ⅰ組瘤胃真菌多集中在同一菌門(mén)下的2個(gè)屬水平中，多樣性顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組。日糧營(yíng)養(yǎng)水平的不同，對(duì)瘤胃中微生物的組成造成影響。

不同的微生物對(duì)飼料的降解能力不同，長(zhǎng)時(shí)間的飼喂不同營(yíng)養(yǎng)水平日糧，使羔羊瘤胃菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變[15-16]。在瘤胃中的 Ascomycota 是真菌界最大的一類微生物，主要參與營(yíng)養(yǎng)循環(huán)中頑固有機(jī)物質(zhì)的降解；Ascomycota 門(mén)中部分真菌也可通過(guò)分泌胞外酶將有機(jī)質(zhì)分解為小分子物質(zhì)后再將小分子吸收進(jìn)胞內(nèi)代謝，它們可以分泌降解纖維素和木質(zhì)素的酶類[17]。隸屬于子囊菌門(mén)的Penicillium是絲狀真菌中最具代表性的菌屬之一，絲狀真菌對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有很強(qiáng)的分解作用,能分泌胞外酶,其菌絲具有機(jī)械穿插作用,能降解難降解有機(jī)物如纖維素和木質(zhì)素,促進(jìn)生物化學(xué)作用[18]。3組羔羊在蛋白水平為 14%時(shí)Penicillium的豐度達(dá)到了 22.49%，在3組中最高；帚枝霉 屬能水解纖維素和木聚糖[19],Aspergillus真菌是一類分布廣泛的絲狀真菌，可降解纖維素、半纖維素和 木質(zhì)素[20-21]，這2種真菌在Ⅱ、Ⅲ組羔羊瘤胃中的豐度均顯著高于Ⅰ組。在Ⅱ組和Ⅲ組，即蛋白水平為 14%和 16%的日糧飼喂下，羔羊瘤胃內(nèi)各纖維消化菌的種類分布較為均勻。

真菌在瘤胃中主要在植物纖維的降解過(guò)程中起主要作用，本試驗(yàn)中通過(guò)提供不同的蛋白水平飼料，發(fā)現(xiàn)Ⅰ組瘤胃真菌的多樣性顯著低于Ⅱ、Ⅲ組。不同的纖維降解菌，在降解過(guò)程中執(zhí)行著不同的功能，日糧飼料的配置會(huì)選用不同的纖維性飼料，這些飼料的物理結(jié)構(gòu)上也不盡相同。因此，瘤胃內(nèi)微生物種類的多樣性，是提高瘤胃對(duì)纖維性飼料降解能力的重要因素[22]。有研究結(jié)果表明[23]，在日糧蛋白(11%,12%,13%)水平增加至 13%時(shí)顯著提高了 DM 和 NDF 的表觀消化率；崔曉鵬等[24]對(duì)藏羔羊的研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)水平影響早期斷奶藏羔羊的生長(zhǎng)發(fā)育,在3種蛋白水平中(10.8%,12.0%,13.2%)12%蛋白水平可提高藏羔羊的日增體質(zhì)量；LUDDEN等[25]給2月齡綿羊飼喂不同蛋白水平(13%,15%,17%)的日糧發(fā)現(xiàn),隨著蛋白水平的提高,NDF和ADF的消化率逐漸上升。從以上研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鞍姿竭^(guò)低時(shí)會(huì)降低羔羊的生長(zhǎng)發(fā)育及消化代謝能力，適當(dāng)提高蛋白水平能夠更好地，為羔羊胃腸道的發(fā)育提供基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中蛋白水平增加至 14%和 16%時(shí)，羔羊瘤胃內(nèi)真菌的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性優(yōu)于低蛋白水平組，能夠?yàn)楦嵫虻纳L(zhǎng)發(fā)育提供良好的發(fā)育基礎(chǔ)。