高羊毛氨酸硒對S.aureus誘導的大鼠乳腺炎抗氧化能力的影響

丁 濤，韓昊洋，崔璐瑩，董俊升，李建基，孟 霞，朱國強，王 亨

(揚州大學 獸醫學院 教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009)

硒是動物體內一種必需微量元素，以硒蛋白的形式發揮抗氧化和抗炎的作用，還參與甲狀腺激素代謝、氧化還原信號轉導和免疫應答的調節[1-2]。動物飼料中主要使用的硒補充劑是無機物形式，特別是亞硒酸鈉。近期研究發現，無機硒存在生物利用率低及毒性高的問題，用有機硒替代無機硒在動物飼料中的應用已引起了廣泛關注[3]。當硒攝入不足時，會引起肌肉營養不良，心肌變性，牛奶和羊毛產量降低，生育力和產仔量減少等健康問題；而當硒攝入過量，會發生硒蓄積中毒，引起肝臟、心肌、脾臟和腎臟病變[4-6]。乳腺炎主要是由細菌感染引起的乳腺炎癥反應，是人類和動物常見的疾病之一[7]。近年來，隨著中國奶牛養殖的逐漸規模化、標準化，乳房炎的防控取得明顯成效，但奶牛乳腺炎仍是損害奶牛福利和食品安全的重要疾病之一，同時也是影響奶牛養殖效益的主要疾病[8]。金黃色葡萄球菌(S.aureus)是乳腺炎中最常見的感染性病原體，但目前對于S.aureus性乳腺炎仍沒有有效的治療方法。研究發現，硒缺乏會導致奶牛圍產期疾病，子宮內膜炎和乳腺炎發病率增加[2]。當奶牛處于缺硒狀態，谷胱甘肽過氧化物酶活性急劇下降，并引起氧化應激，而補充硒可減輕氧化應激[2,6]。此外，在奶牛妊娠后期添加硒酵母，可以增加血漿硒的水平，增強抗氧化酶的活力，改善抗氧化功能，并有效減輕早期哺乳期發生的氧化應激，改善動物健康狀況[5]。高羊毛氨酸硒(selenohomolanthionine,SeHLan)作為一種新型氨基酸有機硒，最早是在日本辣蘿卜中被發現。在高羊毛氨酸硒對大鼠的毒性試驗研究中，證明了相比硒代蛋氨酸(SeMet)，其不在胰腺蓄積，因此SeHLan有望成為不引起胰腺損傷的新型硒的補充來源[9-10]。但目前對其在病原微生物感染過程中的作用研究較少。本研究通過添加不同水平SeHLan，研究其對S.aureus誘導的乳腺炎大鼠的血液、乳腺和肝臟抗氧化能力以及對乳腺組織硒蛋白基因表達的影響，揭示補充SeHLan對乳腺炎大鼠的影響，并為SeHLan的生產應用提供理論基礎和應用支持。

1 材料與方法

1.1 日糧組成及硒的來源試驗采用基于氨基酸為配方的基礎日糧，購自常州鼠一鼠二公司。日糧組成及營養成分見表1，不含任何形式的硒。SeHLan由上海英聯貿易有限公司提供，通過添加補充硒。

表1 基礎飼糧組成及營養成分 g

1.2 試驗動物及處理24只健康懷孕的Wistar大鼠，8～10周齡，體質量200～250 g，由揚州大學實驗動物中心提供，于配種后單籠飼養，提供基礎日糧和飲水，室溫為(24±1)℃，明暗周期為12 h。SeHLan以缺硒、正常硒和富硒的劑量添加，即0.03，0.15,1.50 mg/kg，從配種后即開始添加飼喂。在分娩后4 d，用異氟烷吸入麻醉大鼠，將100 μLS.aureus(2×107CFU/mL) 分別通過乳導管注入兩側第4對乳腺中，對照組注射等量的PBS。將其分為4組:對照組(添加硒為0.15 mg/kg)，乳腺中注射PBS；試驗組為S.aureus感染Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，分別添加0.03，0.15,1.50 mg/kg 硒，并進行乳腺內注射S.aureus。

1.3 樣品采集在乳腺內注射S.aureus后12 h，用異氟烷進行吸入麻醉。對腹部進行消毒，切開并分離腹部皮膚，分離并收集乳腺組織和肝臟，并采集血液，分離血清。

1.4 主要試劑和儀器S.aureus，由揚州大學獸醫外科實驗室分離自奶牛乳腺炎，并鑒定保存； SOD、MDA、GPX和T-AOC檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol、反轉錄試劑盒和SYBR qPCR MIX購自南京諾唯贊生物公司；紫外可見分光光度計購自上海光譜儀器有限公司；酶標儀購自美國Bio Tek公司；Nanodrop 2000分光光度計購自美國Thermo Scientific公司；CFX ConnectTM熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.5 熒光定量PCR檢測大鼠乳腺組織中硒蛋白mRNA表達根據NCBI數據庫中大鼠GPX1、GPX4、Sepp1和β-actin基因序列，并利用Primer Premier 6.0軟件設計特異性引物。引物序列見表2，由南京擎科生物科技公司合成。TRIzol試劑提取乳腺組織的總RNA，使用Nanodrop 2000分光光度計測量RNA的濃度和純度，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性。使用反轉錄試劑盒將1 000 ng RNA反轉錄為cDNA。反應體系總體積為20 μL，SYBR qPCR MIX 10 μL，cDNA模板1.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6.5 μL。使用CFX ConnectTM實時熒光定量PCR，設置反應條件為95℃預變性2 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環40次；95℃ 15 s，60℃ 5 s，95℃ 50 s。使用2-△△Ct相對定量的方法計算每個靶基因的相對表達量。β-actin 被用作內參基因。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.6 氧化與抗氧化相關指標檢測將乳腺組織測質量，用組織研磨機研磨成10%勻漿，4℃、2 000 r/min離心10 min，去除上層乳脂，再次離心去除沉淀，收集上清液。類似的方法對肝臟進行勻漿，收集上清液。然后，進行乳腺、肝臟和血清中氧化應激相關指標T-AOC、GPX、SOD和MDA的檢測。

2 結果

2.1 不同硒水平對S.aureus誘導的大鼠乳腺炎乳腺組織硒蛋白mRNA表達的影響如圖1所示，與對照組相比，S.aureus感染后，組Ⅱ大鼠乳腺GPX1、GPX4和Sepp1的mRNA表達極顯著降低(P<0.01)。與Ⅱ組相比，Ⅰ組乳腺中GPX1和Sepp1的mRNA顯著下降(P<0.05)，Ⅲ組大鼠乳腺GPX1和Sepp1的mRNA水平極顯著升高(P<0.01)。缺硒或者富硒對乳腺組織中GPX4 的mRNA表達的影響差異不顯著。

1.GPX1 mRNA相對表達量；B.Sepp1 mRNA相對表達量；C.GPX4 mRNA相對表達量圖1 乳腺組織中硒蛋白mRNA表達水平

2.2 不同硒水平對S.aureus誘導的大鼠乳腺炎乳腺組織抗氧化相關指標的影響如圖2所示，與對照組相比，S.aureus感染后，Ⅱ組乳腺中T-AOC、GPX和SOD的活力顯著升高(P<0.05)，MDA水平下降但無統計學差異。與Ⅱ組相比，Ⅰ組大鼠乳腺組織中的T-AOC、GPX和SOD的活力顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)。Ⅲ組大鼠乳腺中 GPX和T-AOC的活力顯著升高(P<0.05)，MDA顯著下降(P<0.05)，而SOD活力無顯著變化。

A.T-AOC活力；B.GPX活力；C.SOD活力；D.MDA含量圖2 乳腺抗氧化相關指標

2.3 不同硒水平對S.aureus誘導的大鼠乳腺炎血清抗氧化相關指標的影響與對照組相比，S.aureus感染后，Ⅱ組大鼠血清中T-AOC、GPX、SOD和MDA變化差異不顯著。與Ⅱ組相比，Ⅰ組大鼠血清中GPX和SOD活力極顯著下降(P<0.01)，T-AOC下降但無差異顯著性，MDA顯著升高(P<0.01)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組大鼠血清中GPX 和T-AOC的活力極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)，MDA濃度顯著下降(P<0.05)，SOD活力差異不顯著。

2.4 不同硒水平對S.aureus誘導的大鼠乳腺炎肝臟組織抗氧化相關指標的影響與對照組相比，S.aureus感染后，Ⅱ組大鼠肝臟中T-AOC、GPX、SOD和MDA變化差異不顯著。與Ⅱ組相比，Ⅰ組大鼠肝臟中GPX和T-AOC的活力極顯著或顯著下降(P<0.01或P<0.05)，MDA極顯著升高(P<0.01)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組大鼠肝臟中GPX活力極顯著升高(P<0.01)，MDA顯著下降(P<0.05)，T-AOC活力升高但無差異顯著性，SOD活力在各組間差異不顯著。

A.T-AOC活力；B.GPX活力；C.SOD活力；D.MDA含量圖3 血清抗氧化相關指標

A.T-AOC活力；B.GPX活力；C.SOD活力；D.MDA含量圖4 肝臟抗氧化相關指標

3 討論

嚙齒動物有24種硒蛋白，許多研究表明硒蛋白轉錄物可以用作評估硒狀態的分子生物標記物。GPX1廣泛存在于各種組織中，在抗氧化防御過程中發揮重要的作用，大鼠硒缺乏GPX1的mRNA水平急劇下降，隨著飲食中硒含量增加，其mRNA表達成S型增加，并在一定的硒水平時達到平臺期[11]。郝宏曉等[12]的研究在奶牛日糧中添加硒也提高了肝臟中GPX1 的mRNA表達。也有研究表明，肝臟中GPX4和Sepp1 的mRNA水平不受大鼠硒狀態的影響[13]。本研究給妊娠期大鼠飼喂不同水平的硒，結果顯示，補硒能顯著促進大鼠乳腺中GPX1和Sepp1的mRNA表達，而缺硒或補硒對GPX4的 mRNA表達無顯著影響。可能GPX4主要存在于睪丸，具有組織特異性，ZHOU等[14]發現當大鼠處于硒缺乏狀態，睪丸中GPX4的mRNA降低。

SUN等[15]研究發現對豬腹腔注射LPS后，25個硒蛋白中有14個硒蛋白的基因表達受到影響。與注射鹽水的豬相比，注射LPS的豬的肝臟中Sepp1、GPX2和Txnrd2 mRNA表達顯著降低，說明在LPS誘導的炎癥過程影響了硒蛋白的代謝。在本研究中，在飼喂正常硒水平的條件下，S.aureus感染后乳腺組織中GPX1、GPX4和Sepp1的mRNA表達極顯著降低，說明乳腺感染S.aureus也影響了硒蛋白的代謝。

動物體內有幾種已知的內源性抗氧化防御機制，第一類是GPX、SOD、CAT等酶抗氧化劑，可減少過氧化氫、脂質和磷脂氫過氧化物，抵抗活性氧積累產生的有害影響，是細胞內抗氧化防御的主要形式[16]。SOD催化超氧自由基生成過氧化氫(H2O2)，H2O2再被GPX和CAT代謝為水。第二類是非酶類的抗氧化劑，通常稱為清除抗氧化劑，主要包括抗壞血酸、尿酸、谷胱甘肽、維生素E和泛醇等。它們通過中和或清除自由基活性。T-AOC是由非酶的和酶的抗氧化系統組成，T-AOC水平反映了清除自由基的能力，對維持細胞內環境的氧化還原平衡很重要。MDA是脂質過氧化物代謝產物，其含量反映了機體內脂質過氧化程度，間接反應細胞的損傷程度。在本研究中，S.aureus感染后乳腺組織中GPX、SOD和T-AOC升高，這可能是機體應對氧化應激產生的一種適應性反應，通過提高抗氧化酶活力來緩解機體的損傷程度。喬娜等[17]的研究發現小鼠精原細胞在缺氧處理后，細胞中產生了大量的MDA和ROS，同時抗氧化酶T-AOC和CAT的活力也顯著升高。研究發現殺蟲脲引起BALB/c小鼠肝臟和腎臟的氧化應激，并且肝臟和腎臟中的抗氧化酶活性顯著增加[18]。這與我們的結果相似，機體或細胞通過提高抗氧化酶活力來對抗不良刺激。MIAO等[19]在鏈球菌大鼠乳腺炎中的研究結果與我們不一致，他們發現在感染后16,24 h，乳腺組織和血清中T-AOC和SOD的活力顯著降低，而MDA含量顯著增加。在本研究中，S.aureus感染后乳腺組織中抗氧化酶活性升高，而對肝臟和血清的氧化應激相關指標均無影響，可能本研究選用的菌株感染引起的損傷較輕微，或感染的時間不夠長，引起的氧化損傷較輕，沒有對肝臟和血清的抗氧化酶活力造成顯著影響。GONG等[5]研究發現于奶牛妊娠后期添加硒酵母，可以增加血漿硒的狀況，增強抗氧化酶的活力，改善抗氧化功能，并有效減輕早期哺乳期發生的氧化應激。本研究中，飼喂缺硒飲食，乳腺、血清和肝臟中MDA含量升高，抗氧化酶活性降低，這表明硒缺乏可引起各種組織氧化損傷。富硒飲食增強了乳腺、血清和肝臟的GPX和T-AOC的活力，降低了MDA的含量。

綜上，妊娠期補充高劑量的SeHLan可提高抗氧化酶活性，增強了機體的抗氧化能力，減輕了S.aureus乳腺炎引起的氧化應激。