飼料中添加沸石對(duì)慢性腎衰犬結(jié)腸尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B及氨轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白R(shí)h表達(dá)的影響

朱道仙，劉 莉*,陸 江，梅素紅,袁華根，趙學(xué)剛

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

在慢性腎衰(CRF)時(shí)，尿素經(jīng)腎排泄障礙，血液中大部分尿素可通過自由擴(kuò)散或經(jīng)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B(UT-B)轉(zhuǎn)運(yùn)彌散入腸道，腸道排泄成為尿素清除的重要途徑[1-2]。但大量尿素進(jìn)入腸道也為結(jié)腸菌群提供了豐富的氮源，會(huì)被含脲酶的細(xì)菌分解產(chǎn)生大量的氨[3]，在氨轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白R(shí)h的作用下這些氨可快速進(jìn)入門靜脈，隨后在肝中重新合成尿素，再次釋放入血，形成了尿素的肝腸循環(huán)，從而減少了尿素經(jīng)腸排泄，使氮質(zhì)血癥不能及時(shí)改善，甚至可導(dǎo)致高血氨癥，嚴(yán)重危害動(dòng)物的生命安全。前期研究發(fā)現(xiàn)用益生菌抑制CRF犬腸道含脲酶菌群后，可改善氮質(zhì)血癥，也證實(shí)了尿素的肝腸循環(huán)會(huì)影響尿素的經(jīng)腸排泄。

沸石是一種含水的鋁硅酸鹽礦物，特殊的結(jié)構(gòu)使其擁有良好的吸附、離子交換、分子篩等作用[4]。大量研究表明，沸石具有維持腸黏膜屏障功能，提高消化酶的活性，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率，抗氧化作用和提高機(jī)體免疫力等多種功能，已被廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)[5-9]。但關(guān)于沸石對(duì)尿素肝腸循環(huán)的調(diào)節(jié)作用研究甚少。為此，本研究在CRF犬飼料中添加沸石，評(píng)價(jià)其對(duì)CRF患犬結(jié)腸尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B及氨轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白R(shí)h表達(dá)的影響，探討其對(duì)尿素經(jīng)腸排泄的調(diào)節(jié)機(jī)制，為沸石在CRF犬飲食療法中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料飼料級(jí)沸石粉，購(gòu)于河南信陽(yáng)萬(wàn)山礦物制品廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組20條2歲左右的中華田園犬，體質(zhì)量為(6±1) kg，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院試驗(yàn)犬房提供。參照王寧等[10]的方法，將15只犬采取腎動(dòng)脈結(jié)扎法制作慢性腎衰模型，第4周末每組隨機(jī)抽取3只犬，檢測(cè)血清肌酐、尿素水平均升高，提示造模成功。然后按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組(MD)、低劑量沸石組(LCD)和高劑量沸石組(HCD)，每組5只。另5只犬只做腹壁切開，作為假手術(shù)對(duì)照組(SOG)。MD組和SOG組飼喂基礎(chǔ)飼料，LCD組為1%沸石飼料，HCD為5%沸石飼料，試驗(yàn)連續(xù) 4 周，整個(gè)試驗(yàn)過程所有犬進(jìn)水及飲食均不受限制。基礎(chǔ)飼料參考《犬營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NRC-2016)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，沸石飼料組成見表2。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

表2 不同沸石含量飼料的配制 %

1.3 尿素氮檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)犬放在代謝籠中24 h，收集尿液用尿素檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于武漢艾美捷科技有限公司)進(jìn)行尿尿素(uUrea)的測(cè)量。然后，經(jīng)頭靜脈采集各組試驗(yàn)犬的血液并制備血清，用M149928-全自動(dòng)干式生化分析儀測(cè)定血清尿素氮(BUN)。同時(shí)，收集新鮮糞便，測(cè)質(zhì)量后按1∶9比例用7%三氯乙酸溶液稀釋攪勻，經(jīng)5 000 r/min離心10 min后取上清液檢測(cè)糞便尿素氮(FUN)，方法同上。

1.4 門靜脈中氨的檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)束后，各組犬取門靜脈抗凝血5 mL，3 000 r/min離心5 min，制備血漿，然后用谷氨酸脫氫酶法測(cè)定氨(NH3)的含量，檢測(cè)試劑盒購(gòu)于長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司。

1.5 結(jié)腸黏膜中相關(guān)基因mRNA表達(dá)豐度測(cè)定試驗(yàn)犬麻醉致死后打開結(jié)腸，清除結(jié)腸內(nèi)容物，在結(jié)腸表面用刀片輕輕刮取，收集黏膜層，一部分置于RNA保存液中，于-80℃保存，用于結(jié)腸黏膜中UT-B、氨轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白R(shí)hb(Rhbg)及氨轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白R(shí)hc(Rhcg)基因mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)。具體步驟：Trizol法提取結(jié)腸組織中總RNA,使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,擴(kuò)增采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行,每管總反應(yīng)體積25 μL,溫度循環(huán)設(shè)計(jì)為95℃ 2 min；95℃ 5 s；60℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)，引物設(shè)計(jì)由上海生工合成(表3)。以β-actin為內(nèi)參，基因表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表3 相關(guān)基因mRNA表達(dá)的引物設(shè)計(jì)

1.6 結(jié)腸黏膜中UT-B、Rhbg及Rhcg蛋白表達(dá)測(cè)定稱取約40 mg結(jié)腸組織,加入1 mL裂解液,采用超聲波震碎法置于冰上操作進(jìn)行勻漿,4℃、10 000 r/min 離心10 min,吸取上清移入干凈EP管內(nèi),運(yùn)用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍，選擇12%分離膠及5%濃縮膠進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、雜交、發(fā)光反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照,利用Image J軟件對(duì)各組蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 沸石對(duì)慢性腎衰犬尿素氮的影響從表4可以看出，MD組的BUN、FUN均顯著高于SOG組，而尿Urea顯著降低(P<0.01)。與MD組比較，HCD組BUN、FUN降低，有顯著性差異(P<0.05)，而LCD組無顯著性差異(P>0.05)。LCD組、HCD組尿Urea與MD組無顯著性差異(P>0.05)。

表4 沸石對(duì)慢性腎衰犬尿素氮的影響

2.2 沸石對(duì)慢性腎衰犬門靜脈血氨的影響由表5可知，MD組門靜脈中氨的水平顯著高于SOG組(P<0.05)，HCD組門靜脈中氨的水平顯著低于MD組(P<0.05)，LCD組與MD組門靜脈中氨的水平無顯著差異(P>0.05)。

表5 沸石對(duì)慢性腎衰犬門靜脈血氨的影響 μmol/L

2.3 沸石對(duì)慢性腎衰犬結(jié)腸黏膜中相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響由圖1可知，與MD組比較，HCD組Rhbg、Rhcg基因和LCD組Rhcg基因的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)。與SOD組比較，MD組Rhbg、Rhcg基因的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。UT-B基因的mRNA表達(dá)水平在各組間均無顯著性差異(P>0.05)。

注：不同小寫字母上標(biāo)表示2組間相互比較，P<0.05。下同圖1 沸石對(duì)慢性腎衰犬結(jié)腸黏膜中Rhcg、Rhbg及UT-B基因 mRNA表達(dá)的影響

2.4 沸石對(duì)慢性腎衰犬結(jié)腸黏膜中UT-B、Rhbg及Rhcg蛋白表達(dá)的影響如圖2A所示，UT-B、Rhbg及Rhcg在各組結(jié)腸中均有不同程度表達(dá)。UT-B在各組間表相對(duì)達(dá)量無顯著變化(圖2B)。HCD組的Rhbg、Rhcg相對(duì)表達(dá)量和LCD組的Rhcg相對(duì)表達(dá)量均低于MD組，差異顯著(P<0.05)；與SOG組比較，MD組的Rhbg、Rhcg相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)(圖2C，D)。

A.3種蛋白在各組中的表達(dá)；B.UT-B；C.Rhbg;D.Rhcg圖2 沸石對(duì)慢性腎衰犬結(jié)腸黏膜中UT-B、Rhbg及Rhcg蛋白表達(dá)的影響

2.5 慢性腎衰犬BUN水平與UT-B、Rhbg及Rhcg相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析對(duì)慢性腎衰犬BUN與Western blot 檢測(cè)的UT-B、Rhbg及Rhcg相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析,可以看出，BUN與UT-B的相關(guān)系數(shù)較低，且沒有顯著性差異(圖3A)，與Rhbg的相關(guān)系數(shù)約為0.75，P<0.05(圖3B)，與Rhcg的相關(guān)系數(shù)最高，P<0.05(圖3C)。說明慢性腎衰犬BUN水平與Rhcg呈強(qiáng)的正相關(guān)，與Rhbg呈中等正相關(guān)，與UT-B無相關(guān)關(guān)系。

圖3 BUN水平與UT-B、Rhbg及Rhcg相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

3 討論

在CRF狀態(tài)下，尿素不能充分經(jīng)腎排泄而蓄積于體內(nèi)，大量尿素通過豐富的腸壁毛細(xì)血管進(jìn)入腸腔，一部分重吸收入血,另一部分在結(jié)腸中的細(xì)菌作用下生成氨,重新吸收入血又為尿素的合成提供了原料，剩余部分隨糞便排出體外。有研究表明，尿毒癥患者平均每天經(jīng)腸道可清除70 g尿素，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康者。研究已經(jīng)證實(shí)，蒙脫石、沸石、藥用炭等可以吸收消化道中尿素[11-13]，但具體的分子作用機(jī)制尚不清楚。而本研究發(fā)現(xiàn)，CRF犬的BUN、FUN均高于SOG組，但給與沸石后顯著降低，而尿中Urea排泄量變化不大，說明CRF時(shí)機(jī)體可經(jīng)腸排泄尿素，沸石可促進(jìn)這一路徑，與上述觀點(diǎn)一致。

尿素可通過簡(jiǎn)單擴(kuò)散由血液穿過腸黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)入腸腔，但由于尿素是極性分子，不易通過細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，可能會(huì)影響CRF時(shí)尿素由血入腸的數(shù)量與速率。研究表明，尿素通道蛋白家族(UT)是一類特異通透尿素的跨膜蛋白，介導(dǎo)尿素在濃度差驅(qū)動(dòng)下快速穿過細(xì)胞膜，其通透速度遠(yuǎn)超過簡(jiǎn)單擴(kuò)散[14]。而UT-B是UT家族中一員，在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞頂膜有大量分布[15]，當(dāng)給予小鼠低蛋白飲食時(shí)，腸道上皮細(xì)胞UT-B的表達(dá)量會(huì)降低，減少氮經(jīng)腸排泄，維持正氮平衡，證實(shí)了UT-B對(duì)尿素從血液向腸腔轉(zhuǎn)移有調(diào)控作用。研究顯示，UT-B介導(dǎo)的細(xì)胞膜尿素通透性是脂質(zhì)雙層膜尿素通透性的50倍[16]。然而本研究發(fā)現(xiàn)，給予CRF犬高劑量沸石后對(duì)UT-B的mRNA和蛋白表達(dá)均無顯著性影響，而且CRF犬的BUN與UT-B表達(dá)量之間無相關(guān)關(guān)系，提示UT-B不是沸石調(diào)節(jié)BUN經(jīng)腸排泄的作用靶點(diǎn)。但最近在小鼠和人類結(jié)腸中又發(fā)現(xiàn)了一種腸道UT-A轉(zhuǎn)運(yùn)體[17]，這表明可能不止一種尿素轉(zhuǎn)運(yùn)體參與了尿素在腸黏膜上皮細(xì)胞上的運(yùn)動(dòng)，沸石是否可能通過其他UT促進(jìn)BUN經(jīng)腸排泄還有待于進(jìn)一步研究。

Rhbg、Rhcg是最近研究發(fā)現(xiàn)的可介導(dǎo)氨轉(zhuǎn)運(yùn)的氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的新成員，廣泛分布于消化道、腎臟、大腦等組織，參與頂端膜和基底膜的氨轉(zhuǎn)運(yùn)[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRF時(shí)結(jié)腸黏膜Rhbg、Rhcg表達(dá)水平和門靜脈血氨均高于SOG組，相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，CRF犬的BUN與Rhbg、Rhcg蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)。這可能由于CRF時(shí)大量尿素進(jìn)入腸道，大部分被結(jié)腸細(xì)菌分解利用產(chǎn)生了過多的氨，刺激Rhbg、Rhcg表達(dá)上調(diào)，加速這些氨進(jìn)入門靜脈，然后可在肝臟中重新合成尿素后再次釋放到血中，增加了BUN水平，降低了BUN的經(jīng)腸清除作用，僅有少部分尿素或氨隨糞便排出體外。給予沸石后，可顯著降低CRF犬結(jié)腸黏膜Rhbg、Rhcg表達(dá)和門靜脈血氨，減少了尿素的肝腸循環(huán)，說明沸石對(duì)CRF犬BUN經(jīng)腸排泄的通路具有促進(jìn)作用，可能與下調(diào)結(jié)腸黏膜Rhbg和Rhcg表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，CRF時(shí)可增強(qiáng)犬的尿素肝腸循環(huán)，減少BUN經(jīng)腸排泄。給予沸石后，可減輕尿素肝腸循環(huán)，降低BUN、FUN和門靜脈血氨，緩解高氮血癥，其機(jī)制可能與下調(diào)結(jié)腸黏膜Rhbg和Rhcg表達(dá)有關(guān)，以飼料中添加5%沸石劑量最佳。