經典途徑細胞焦亡模型的構建

傅心雨，石玉華，鄭夢潔，呂 倩，師福山

(浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058)

細胞焦亡(pyroptosis)是一種依賴Caspase(含半胱氨酸蛋白水解酶)的具有促炎性的程序性細胞死亡，其特征是細胞膜失去完整性并形成孔洞，導致細胞腫脹破裂，該過程在抵抗微生物感染中起到重要作用[1]。細胞焦亡的發生可分為經典途徑和非經典途徑，分別依賴Caspase-1和Caspase-4/5/11[2]。當細胞中的模式識別受體(PRR)接受病原刺激信號后，炎癥小體組裝并導致自身激活以及Caspase-1的活化，活化的Caspase-1一方面切割Pro-IL-1β產生成熟的IL-1β，另一方面切割GSDMD產生N端GSDMD(GSDMD-p30)并在細胞膜上形成孔洞，導致細胞腫脹破裂，為經典途徑的細胞焦亡[3-5]。非經典途徑為小鼠Caspase-11或人Caspase-4/5的前體直接識別并結合脂多糖(LPS)從而導致Caspase-4/5/11活化并直接切割GSDMD，導致細胞焦亡[6-7]。因此，細胞焦亡被認為是GSDMD介導的程序性細胞死亡，其中GSDMD屬于Gasdermin家族，在哺乳動物中高度保守，并在不同組織和細胞中廣泛表達[2,8]。其N端結構域與C端結構域形成自抑制結構，導致靜息狀態下的GSDMD沒有活性，僅當活化的Caspase-1或Caspase-4/5/11作用于天冬氨酸切割位點時，GSDMD才能被切割并且在胞膜上打孔[9-10]。GSDMD也與諸多基因性疾病相關，但其激活機制尚不清楚，本研究旨在構建經典途徑的細胞焦亡體外模型，為進一步研究激活機制建立穩定的模型。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株及細胞株真核表達質粒p3×FLAG-CMV-7.1、pCMV-N-MYC、pcDNA3.1-MYC-C及人胚腎細胞HEK293T細胞株均由本實驗室保存；感受態細胞E.coli.DH5α購于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要試劑RNA-Quick Purification Kit購于上海奕杉生物科技有限公司；PCR試劑盒、反轉錄試劑盒及DNA Marker購于南京諾唯贊(Vazyme)生物科技有限公司；PCR產物純化試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅢ、Xba1及T4DNA連接酶購于NEB公司；10%一步法凝膠制備試劑盒購于杭州弗德生物科技有限公司；Lipo8000TM轉染試劑、QuickBlockTMWestern封閉液、QuickBlockTMWestern一抗稀釋液購于上海碧云天生物技術有限公司；anti-FLAG、anti-MYC抗體購于Sigma公司；HRP標記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG購于Absin公司；LDH檢測試劑盒購于Promega公司；PI染色檢測試劑盒購于BD Pharmingen公司。

1.3 細胞總RNA提取及cDNA合成提取人THP-1細胞總RNA后，使用PrimeScript RT reagent Kit配制體系，PCR儀內按程序(37℃ 15 min→85℃ 5 s→16℃)完成反轉錄，合成cDNA。

1.4 引物設計NCBI數據庫中查找人源Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-P30的編碼序列，根據要求設計不同引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。各個基因片段引物設計序列見表1。

表1 Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-p30基因片段引物設計

1.5 PCR擴增以合成的cDNA為模板，通過PCR擴增Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-p30基因，得到目的片段，反應體系如表2所示。設置循環參數：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環；72℃徹底延伸5 min。反應完畢后，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗證產物。

表2 PCR擴增目的基因反應體系

1.6 質粒構建PCR產物經純化試劑盒清潔回收后，將各DNA片段和空載分別使用相應酶進行雙酶切，其中Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL片段及p3×FLAG-CMV、pCMV-N-MYC空載分別使用EcoRⅠ和KpnⅠ酶進行酶切；H-GSDMD-p30片段及pcDNA3.1-MYC-C空載體分別使用HindⅢ和Xba1酶進行酶切。雙酶切完成后回收各個片段，將DNA片段和載體用T4DNA連接酶連接(16℃,12 h)。連接產物轉化至大腸桿菌Ecoli.DH5α感受態細胞內，取適量菌液均勻涂布在含有相應抗生素的固體培養基上，37℃培養過夜后挑取單菌落于液體培養基中擴繁，37℃搖菌16 h后提取質粒，通過雙酶切驗證片段插入載體情況。另外，將重組質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結果正確的質粒分別命名為p3XFLAG-CMV-Caspase-1、Myc-CMV-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30。

1.7 HEK293T細胞轉染將HEK293T細胞約0.8×105/孔接種于24孔板內，待細胞貼壁密度達70%～80%后進行轉染，轉染前1 h更換新鮮的含10% FBS的DMEM培養液500 μL，置于37℃、5%CO2培養。每孔轉染方法如下：二無DMEM培養液中加入0.8 μL Lipo8000TM及重組質粒混合至總體積25 μL，棄掉培養皿中25 μL培養基，將25 μL 轉染工作液加入相應孔內，輕晃混勻。轉染24 h后，棄培養基，加入RIPA蛋白裂解液提取細胞內蛋白，通過Western blot方法驗證Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-p30蛋白表達。

1.8 蛋白表達驗證提取得到的細胞內蛋白與5×Loading buffer混合煮沸10 min后冰浴冷卻，取20 μL 樣品通過10% SDS-PAGE電泳分離，經300 mA 恒流電轉至PVDF膜上，用QuickBlockTMWestern封閉液在室溫下搖床孵育30 min，不同蛋白分別加入相應抗體置于4℃孵育過夜。次日用TBST溶液洗3次，每次10 min。隨后加入對應二抗，室溫下搖床孵育1 h。孵育結束后用TBST溶液洗3次，每次10 min。在ECL光化學成像儀內進行顯色，檢測目的蛋白表達情況。

1.9 質粒共轉染HEK293T細胞約0.8×105/孔接種于24孔板內，待細胞貼壁密度達70%～80%后進行轉染；共轉染時所用質粒量分別為：Pro-Caspase-1 500 ng、H-GSDMD-FL 500 ng。轉染24 h 后離心取上清，通過試劑盒檢測LDH的釋放情況，吸除剩余培養基，500 μL PBS清洗3次后，加入PI染料避光反應15 min，隨后用PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察結果。

1.10 數據分析數據采用GraphPad Prism 8.0軟件進行分析作圖，試驗組比較采用t檢驗；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 結果

2.1 Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-p30基因片段擴增以合成的cDNA(THP-1)為模板，PCR方法擴增Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-p30基因片段，產物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖1可見擴增條帶大小與目的條帶大小一致。

M.DL2000 DNA Marker;1.Rro-Caspase-1;2.H-GSDMD-FL;3.H-GSDMD-p30圖1 PCR擴增Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-p30基因

2.2 重組表達質粒的構建連接產物分別轉化至EcoliDH5α感受態細胞內，挑取單菌落擴增后提取質粒，分別進行雙酶切驗證：重組質粒p3×FLAG-CMV-Caspase-1使用NotⅠ和SalⅠ進行雙酶切，酶切產物分別為4 700，1 215 bp；重組質粒Myc-CMV-hGSDMD-FL使用SalⅠ和NotⅠ雙酶切，酶切產物分別為3 776，1 452 bp；重組質粒pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30使用HindⅢ和ApaⅠ雙酶切，酶切產物分別為5 380，825 bp。產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，各個重組質粒經酶切后均符合預期大小，測序結果正確進一步表明重組質粒均構建成功。

M.DL5000 DNA Marker;1.p3XFLAG-CMV-Caspase-1;2.Myc-CMV-hGSDMD-FL;3.pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30圖2 各重組質粒酶切驗證

2.3 蛋白表達驗證將構建成功的p3×FLAG-CMV-Caspase-1、Myc-CMV-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30質粒通過Lipo8000TM分別轉染至HEK293T細胞中，24 h后提取細胞蛋白，通過Western blot方法檢測各蛋白表達水平，融合蛋白p3×FLAG-CMV-Caspase-1大小為48.7 kDa、Myc-CMV-hGSDMD-FL大小為54.5 kDa、pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30大小為32.0 kDa，(圖3)。結果表明重組質粒p3×FLAG-CMV-Caspase-1和Myc-CMV-hGSDMD-FL可以在HEK293T細胞內成功表達，單獨轉染GSDMD-p30由于導致嚴重的細胞焦亡，胞漿內并不能檢測到p30片段。

圖3 Western blot檢測各融合蛋白在HEK293T細胞中的表達

2.4 細胞焦亡模型的體外構建將Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL、Pro-Caspase-1+H-GSDMD-FL及H-GSDMD-p30質粒分別轉染至HEK293T細胞中，24 h后離心收集上清液檢測LDH含量，同時提取細胞中蛋白，通過Western blot驗證蛋白表達情況，結果如圖4所示。GSDMD-FL條帶下方可見一條顯著的切割條帶，與GSDMD-p30大小相符，另外Caspase-1與GSDMD-FL共轉的LDH結果也顯著升高，與GSDMD-p30單獨轉染相似，表明Caspase-1將GSDMD切割成GSDMD-p30導致胞膜打孔，釋放LDH，出現了顯著的焦亡現象。此外，對細胞進行PI染色，在熒光顯微鏡下觀察可見，共轉組與GSDMD-p30單轉組染色顯著，如圖5所示，與上述情況相一致。以上結果均表明HEK293T細胞中經典途徑細胞焦亡模型的成功構建。

圖4 質粒轉染HEK293T細胞后上清中LDH含量及Western blot驗證蛋白表達

圖5 質粒轉染HEK293T細胞后PI染色情況(100 nm)

3 討論

細胞焦亡是一種促炎性的細胞程序性死亡方式，普遍存在于脊椎動物中，是先天性免疫效應機制[6,9,11]。在病原體相關分子模式(PAMP)及危險相關分子模式(DAMP)刺激下，細胞內的模式識別受體識別此類信號，通過接頭蛋白ASC與Caspase-1前體結合形成多蛋白復合物，從而使得Caspase-1活化[2]，為經典途徑的細胞焦亡。據報道GSDMD是所有炎癥性Caspase的底物，在細胞焦亡中起到關鍵作用[6,12]。而進一步探究GSDMD介導的細胞焦亡的激活機制，將有助于研究自身炎癥性疾病的致病機制并為治療方案提供新思路。因此，本研究通過構建經典途徑細胞焦亡模型的相關質粒，并轉染至HEK293T細胞中驗證表達，最終成功構建經典途徑的細胞焦亡模型，為進一步探究焦亡激活機制以及開發炎性疾病相關藥物提供體外模型基礎。