丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的治療作用及機制

姜 鯤,尹義江,陳峙峰,鄧旭明,呂強華*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.吉林省牧業(yè)信息中心，吉林 長春130062；3.吉林省牧碩養(yǎng)殖有限公司，吉林 長春130062；4.吉林市豐滿區(qū)小白山鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林 吉林市 132000)

1885年美國獸醫(yī)學(xué)家丹尼爾·埃爾蒙·薩蒙和希爾博得·史密斯首次發(fā)現(xiàn)沙門菌，并命名為沙門菌屬[1]。沙門菌(Salmonella)是一種兼性厭氧革蘭陰性菌，在自然界廣泛分布，目前經(jīng)鑒定的血清型超過2 600種，我國報道已有292個血清型[2]。沙門菌感染畜禽引起不同的臨床表現(xiàn)，可導(dǎo)致自限性胃腸炎、傷寒、副傷寒和系統(tǒng)性感染等疾病[3]，對養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，嚴重阻礙畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來，歐洲食品安全局報道在人類食源性疾病的各種誘因中沙門菌的危害已躍居第二位。在我國，沙門菌引發(fā)食物中毒的事件更是屢見不鮮，嚴重威脅人類的生命安全[4]。沙門菌作為一種人畜共患病原菌造成的危害已經(jīng)不容忽視，迫切需要有效的方法和手段解決面臨的難題。

畜禽生產(chǎn)中主要依靠抗生素治療沙門菌感染，但抗生素的不合理使用導(dǎo)致細菌耐藥性逐年增強和耐藥譜逐漸加寬，常規(guī)抗生素的治療效果已經(jīng)陷入困境。因此，尋求新型抗菌藥物或抗菌策略對抗耐藥菌的感染迫在眉睫。研究表明，沙門菌的致病性主要依賴于2個毒力島(SPIs，Salmonellapathogenicity islands)及其編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)[5]。SPI-1編碼的T3SS通過將效應(yīng)蛋白注射至宿主細胞，在入侵腸上皮細胞中發(fā)揮重要作用，而SPI-2編碼的T3SS調(diào)控細菌在宿主細胞內(nèi)的存活、復(fù)制和增殖[6]。相比常規(guī)抗生素直接殺傷或殺滅病原菌的作用機制，以細菌生命過程非必需成分(如沙門菌T3SS)為靶標(biāo)的抗毒力療法成為一種理想的藥物研發(fā)策略。

丁香是一味古老的中藥，其根、莖、葉、花和果都可入藥，在藥學(xué)領(lǐng)域中被廣泛研究，具有清熱燥濕、解毒、消炎、利濕退黃的作用[7-9]。在本研究中，通過制備的丁香油口服液，發(fā)現(xiàn)丁香油口服液抑制沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運功能，通過抗菌活性測定、蛋白免疫印跡(Western blot)和熒光定量PCR等研究丁香油口服液抑制沙門菌T3SS功能的作用機制，并評價丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的保護效果，旨在為丁香油口服液治療沙門菌感染的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，以期為抗沙門菌感染提供候選制劑。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞與試劑雞白痢沙門菌CVCC1789購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；抗ICDH血清由美國普渡大學(xué)羅招慶教授饋贈；人宮頸癌細胞HeLa來源于北京協(xié)和細胞中心；丁香油口服液(規(guī)格：100 mL/瓶，丁香酚含量不低于80 g/L)，由吉林大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實驗室提取和制備；空白輔料(規(guī)格：含二丁基羥基甲苯0.1 g,檸檬酸0.2 g,聚山梨酯-80為50 g，乙醇150 mL，PEG400加至1 L)；硫酸新霉素由河南新正好生物工程有限公司生產(chǎn)(規(guī)格：100 g∶5 g，500萬單位)；TSB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；含報告質(zhì)粒sipA-PEX233菌株購自美國Abcam公司；6×CCF4試劑和DMEM細胞培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司。

1.2 試驗動物1日齡AA+肉雛雞購自吉林大學(xué)實驗動物中心，正常飼喂至5日齡備用。

1.3 主要儀器生物安全柜(HDL)，購自哈東聯(lián)有限公司;恒溫振蕩器(THZ-82)，購自上海躍進醫(yī)療器械廠；電子天平(BSA124S/224S-CW)，購自德國賽多利斯；組織研磨儀，購自上海凈信生物科技有限公司；免疫熒光顯微鏡，購自日本奧林巴斯；電泳儀、垂直蛋白電泳槽和半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀，購自美國Bio-Rad；Tanon 4200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；普通光學(xué)顯微鏡、手術(shù)刀、眼科鑷和眼科剪等。

1.4 丁香油口服液對沙門菌T3SS抑制作用

1.4.1HeLa細胞的培養(yǎng) 將液氮中凍存的HeLa細胞放置在37℃水浴鍋中快速融化。1 000 r/min離心5 min后棄上清，使用含有10%胎牛血清和1×雙抗(青霉素/鏈霉素)溶液的DMEM高糖完全培養(yǎng)基輕柔重懸，將懸液加入細胞培養(yǎng)瓶中，向瓶中補充4 mL完全培養(yǎng)基混合均勻，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱，5% CO2條件下培養(yǎng)。待瓶底細胞融合至70%～80%時，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.4.2細胞感染 按1.5×104個/孔將HeLa細胞接種于96孔板，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)16～18 h。含報告質(zhì)粒的沙門菌CVCC1789::SipA-TEM于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日按1∶100擴大培養(yǎng)，加入終質(zhì)量濃度為200 mg/L丁香油口服液或等量空白輔料，置于37℃和200 r/min水平搖床繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(D600 nm=1.0左右)。1 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS清洗3次，制備菌懸液。按細菌∶細胞=50∶1的比例感染HeLa細胞，1 000 r/min離心5 min后靜置于37℃培養(yǎng)箱孵育90 min。吸出96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入CCF4工作試劑100 μL，室溫避光孵育45 min 后，在熒光顯微鏡下觀察不同處理組細胞的熒光(藍色或綠色)情況。

1.5 丁香油口服液對體外抗菌活性測定

1.5.1最小抑菌濃度(MIC)的測定 根據(jù)CLSI(Clinical And Laboratory Standards Institute)公布的標(biāo)準(zhǔn)方法M7-A8，測定丁香油口服液對沙門菌的MIC。將雞白痢沙門菌 CVCC1789接種至2 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜待用，用新鮮LB培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至5×105CFU/mL，隨后加入不同質(zhì)量濃度的丁香油口服液倍比稀釋，使其終質(zhì)量濃度為0，4，8，16，32，64，128，256，512，1 024 mg/L，每孔體系為100 μL，另設(shè)LB純培養(yǎng)基陰性對照組和不加丁香油口服液的陽性對照組，37℃靜置培養(yǎng)24 h，以無細菌生長的最低藥物質(zhì)量濃度作為丁香油口服液的MIC。

1.5.2丁香油口服液對沙門菌生長曲線的測定 將過夜培養(yǎng)的CVCC1789按1∶50擴培于100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm=0.3。將菌液等量分裝到5個50 mL的三角錐形瓶中，同時加入不同質(zhì)量濃度的丁香油口服液(終質(zhì)量濃度分別為0，25，50，100，200 mg/L。置于37℃、200 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔1 h測定菌液的D600 nm值并記錄，繪制細菌的生長曲線。

1.6 丁香油口服液對沙門菌T3SS的作用機制

1.6.1Western blot檢測沙門菌T3SS主要效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)的表達 沙門菌CVCC1789于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)過夜培養(yǎng)，次日按1∶100擴培，加入丁香油口服液(終質(zhì)量濃度為200 mg/L)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，10 000 r/min離心5 min 收集菌體，加入100 μL 1×loading buffer(含β-巰基乙醇)重懸菌體，置于100℃水浴鍋中煮沸6 min。取上述樣品進行SDS-PAGE電泳，用半干式轉(zhuǎn)膜儀將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。使用沙門菌SipA抗血清(鼠來源)、沙門菌SipB抗血清(鼠來源)、HilA抗血清(鼠來源)和 ICDH 抗血清(兔來源)分別常溫孵育2 h 后，羊抗鼠或羊抗兔常溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，置于Tanon 4200顯影儀采集圖像。

1.6.2RT-PCR法檢測沙門菌SPI-1基因 本研究參照基因組序列信息詳細的鼠傷寒沙門菌SL1344進行檢測。挑沙門菌CVCC1789單菌落于LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日1∶20擴培，加入終質(zhì)量濃度分別為0,200 mg/L的丁香油口服液，37℃培養(yǎng)4 h。使用Trizol法提取細菌總RNA，進行一步法反轉(zhuǎn)錄，使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀檢測和分析。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，序列如下：

sipA-F 5′-GTCATTCGCGTGTGGATTCG-3′，sipA-R 5′-TTCGGATGAAGCGTTGGTCA-3′；

sipB-F 5′-GGGCAGATGATACCCGATGG-3′，sipB-R 5′-AAGAGAGAAGCGGGTTGGTG-3′；

hilA-F 5′-AAGAAGCGACAGAGGCGAAA-3′，hilA-R 5′-TATCCTGCTCACCCTGGGAA-3′；

FliC-F 5′-CGGAAGCGGCTGCTACAAC-3′，F(xiàn)liC-R 5′-CGGCTACGGGCAGAAGTCA-3′；

FliC作為內(nèi)參基因。

1.7 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的治療作用

1.7.1分組與處理 將肉雛雞隨機分組，每組20只。分組及處理方法見表1。

表1 試驗動物分組及處理方法

1.7.2判定指標(biāo) 分別于給藥后3，7,12 d觀察并記錄各組雛雞臨床癥狀。雞沙門菌病臨床癥狀為精神萎頓、拉白色漿糊狀稀糞及糊肛等。

分別于給藥后3,7 d隨機抽取5只及給藥后12 d 剖檢剩余所有雛雞，觀察肝臟、脾臟和盲腸病理變化。典型病理變化：肝臟外觀呈土黃色，出現(xiàn)針尖大出血點和灰白色的壞死灶，質(zhì)地脆弱；脾臟呈現(xiàn)紅褐色，腫脹，有出血點(斑)；盲腸出現(xiàn)一定程度的積糞。

給藥前各組全部雛雞(20只/組)和給藥后12 d各組剩余雛雞(10只/組)分別稱體質(zhì)量，以健康對照組增重率為100%計，計算平均增重和相對增重率。

臨床癥狀和病理變化作為療效判定主要指標(biāo)，體質(zhì)量變化情況作為次要指標(biāo)。

治愈：治療后臨床癥狀和病理變化消失，判定治愈。

有效：治療后臨床癥狀和病理變化顯著緩解，判定有效。

無效：臨床癥狀和病理變化未顯著緩解，判定無效。

治愈率=(組內(nèi)治愈數(shù)/組內(nèi)總數(shù))×100%

有效率=(組內(nèi)有效數(shù)/組內(nèi)總數(shù))×100%

總有效率=治愈率+有效率

無效率=(組內(nèi)無效數(shù)/組內(nèi)總數(shù))×100%

2 結(jié)果

2.1 丁香油口服液抑制沙門菌T3SS的功能如圖1所示，含報告質(zhì)粒PEX233-SipA的CVCC1789::SipA-TEM菌株感染HeLa細胞后絕大多細胞呈藍色熒光；空白輔料對照組大多細胞呈現(xiàn)藍色熒光；200 mg/L丁香油口服液組大多數(shù)細胞呈綠色熒光，說明丁香油口服液阻止沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白SipA轉(zhuǎn)運至HeLa細胞，抑制沙門菌T3SS的功能。

圖1 丁香油口服液對沙門菌T3SS功能的抑制作用

注：感染組，CVCC1789::SipA-TEM感染；感染+丁香油口服液組，200 mg/L丁香油口服液預(yù)處理CVCC1789::SipA-TEM后感染；感染+空白輔料組，空白輔料預(yù)處理CVCC1789::SipA-TEM后感染。藍色熒光代表沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白SipA正常轉(zhuǎn)運至宿主細胞；綠色熒光代表沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白SipA不能正常轉(zhuǎn)運至宿主細胞。

2.2 丁香油口服液對沙門菌無抗菌活性如圖2所示，不同質(zhì)量濃度的丁香油口服液處理組沙門菌CVCC1789的生長曲線與對照組相似，說明丁香油口服液對沙門菌的生長無顯著性影響；同時，丁香油口服液對沙門菌CVCC1789的MIC值大于1 024 mg/L，該結(jié)果表明丁香油口服液對沙門菌無抗菌活性。

圖2 丁香油口服液對沙門菌生長的影響

2.3 丁香油口服液降低沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)及調(diào)控蛋白(HilA)的表達通過Western blot檢測丁香油口服液對沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)表達的影響。由圖3可知，相比對照組，質(zhì)量濃度為200 mg/L的丁香油口服液抑制沙門菌CVCC1789 T3SS主要效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)的表達。

圖3 丁香油口服液對沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白和調(diào)控蛋白的影響

2.4 丁香油口服液抑制沙門菌SPI-1相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄上述研究表明丁香油口服液抑制沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)控蛋白(HilA)的表達。為進一步研究丁香油口服液的作用機制，通過熒光定量PCR測定丁香油口服液對沙門菌SPI-1相關(guān)基因(sipA、sipB和hilA)轉(zhuǎn)錄的影響。由圖4可知，質(zhì)量濃度為200 mg/L的丁香油口服液顯著降低上述基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。

圖4 丁香油口服液對沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白及調(diào)控蛋白基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

2.5 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的治療作用

2.5.1臨床癥狀 健康對照組未出現(xiàn)異常，試驗過程未發(fā)生沙門菌感染；感染對照組和空白輔料對照組，給藥后7，12 d所有雛雞表現(xiàn)精神萎頓和拉白色稀糞的臨床癥狀，表明感染模型建立成功(圖5)，空白輔料對雞沙門菌病無任何療效。由表2可知，給藥后12 d丁香油口服液不同劑量組和硫酸新霉素對照組分別有45%，40%，30%，30%的雛雞呈現(xiàn)臨床癥狀，表明丁香油口服液和硫酸新霉素均可緩解感染雛雞的臨床癥狀，且中劑量和高劑量組與硫酸新霉素組臨床癥狀相近。

圖5 發(fā)病雞臨床癥狀

表2 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的臨床癥狀觀察 %

2.5.2病理變化 如表3所示，健康對照組未出現(xiàn)異常變化，說明飼養(yǎng)過程中未發(fā)生感染；感染對照組和空白輔料組雛雞肝臟呈現(xiàn)不同程度淤血，脾臟腫大和盲腸積糞等典型病變，說明感染模型成功建立，空白輔料對雞沙門菌病無任何治療作用(圖6)。丁香油口服液不同劑量和硫酸新霉素對照組在給藥后呈現(xiàn)病理變化的雛雞數(shù)量逐漸減少，低劑量組療效較差，中劑量和高劑量與硫酸新霉素療效相近。

圖6 給藥后12 d各組剖檢病理變化

表3 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的病理變化觀察 %

2.5.3體質(zhì)量變化 如表4所示，健康對照組、感染對照組、丁香油口服液不同劑量組、硫酸新霉素對照組和空白輔料組平均增重分別為 653.76，457.58，576.40，620.43，624.46，628.96，465.84 g；以健康對照組增重率為100.00%計，感染對照組、丁香油口服液組、硫酸新霉素對照組和空白輔料對照組的相對增重率分別為69.99%，88.17%，94.90%，95.52%，96.21%，71.26%，感染對照組和空白輔料對照組相對增重率較低；中劑量和高劑量組平均增重和相對增重率與硫酸新霉素對照組相近，表明丁香油口服液可有效緩解沙門菌感染所造成體質(zhì)量下降趨勢。

表4 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病體質(zhì)量變化統(tǒng)計 g

2.5.4治療效果統(tǒng)計 由表5可知，丁香油口服液不同劑量組和硫酸新霉素對照組治愈率分別為45%，60%，65%，70%，總有效率分別為65%，80%，85%，90%，表明丁香油口服液中劑量對雞沙門菌感染具有良好治療作用，與硫酸新霉素療效相當(dāng)。

表5 丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病治療試驗統(tǒng)計結(jié)果 %

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)沙門菌以來，作為一種臨床上常見人畜共患病原菌，沙門菌病仍是困擾人類和動物的一種多發(fā)性疾病[10]。尤其在一些國家和地區(qū)，沙門菌已經(jīng)成為食源性高致病菌，具有高傳染率和高傳播率的特點[11]。隨著生活水平的提高和環(huán)保意識的增強，人們對食品安全和環(huán)保問題的要求越來越高，加上如今規(guī)模化和集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，選擇健康有效的抗菌藥物和抗菌策略防治畜禽沙門菌感染，對于促進畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和提供健康安全的畜禽產(chǎn)品至關(guān)重要。

相比于傳統(tǒng)抗生素通過抑制細菌必需成分易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性的特點，以細菌生命過程非必需成分(如溶血素、菌毛、鞭毛和Ⅲ型分泌系統(tǒng))為靶標(biāo)的抗毒力藥物研發(fā)已成為人類關(guān)注的熱點。近年來，已有許多以細菌致病過程的毒力因子為靶標(biāo)的化合物和天然小分子抑制劑陸續(xù)被報道出來[12-15]。在我國，中藥的應(yīng)用歷史悠久，為抗細菌感染新藥研發(fā)提供了巨大的天然寶庫[16-18]。基于中藥清熱解毒等功效的臨床實踐，發(fā)現(xiàn)中藥抗感染是以細菌致病過程的毒力因子為靶標(biāo)的作用機制，來源廣泛、成本低廉和綠色環(huán)保的中藥成為抗細菌毒力策略中藥物研發(fā)的理想選擇。

在本研究中，通過建立沙門菌T3SS抑制劑的篩選平臺，發(fā)現(xiàn)丁香油口服液顯著抑制沙門菌T3SS的功能，并對其作用機制進行初步探索。同時，建立人工感染雞沙門菌病模型并對丁香油口服液的治療效果進行評價，以臨床癥狀、病理損傷及體質(zhì)量情況等指標(biāo)評價丁香油口服液對人工感染雞沙門菌病的保護效果。結(jié)果表明，丁香油口服液通過抑制沙門菌SPI-1相關(guān)編碼基因(sipA、sipB和hilA)的轉(zhuǎn)錄，降低效應(yīng)蛋白(SipA和SipB)和調(diào)節(jié)蛋白(HilA)表達抑制沙門菌T3SS功能的作用機制；體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)丁香油口服液有效降低感染肉雞的病理損傷，減輕臨床癥狀和緩解體質(zhì)量下降趨勢，顯著提高感染肉雞的治愈率和有效率。綜上所述，丁香油口服液是一種治療沙門菌感染的潛在制劑，該研究也為它的臨床開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。