寧夏地區寵物源MRSA對四環素類藥物耐藥性及外排泵分子特征的分析

馬 靚，馬 強，李 娜，毛彥妮，彭何濤，張蒙蒙，康馨勻，王 鑫，王桂琴

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021)

金黃色葡萄球菌隨著抗生素的廣泛使用，甚至濫用，產生了嚴重的耐藥性[1]。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)衍生出典型的mecA耐藥基因[2],其編碼的青霉素結合蛋白PBP2a導致對該菌對β-內酰胺類藥物的高度耐藥[3]。此外，金黃色葡萄球菌還通過可移動基因元件獲得耐藥性[4]，MRSA該種超級耐藥菌株逐漸演變出的高度耐藥與廣泛耐藥問題，已變得不容忽視[5]。

四環素類抗生素廣泛用于治療革蘭陽性和陰性細菌、細胞內支原體、衣原體和立克次氏體引起的感染，也是動物使用最多的抗生素之一，但近年該類藥物的耐藥性已愈發突出[6]。細菌針對四環素的耐藥機制主要有3個，可能單獨存在，也可能多個存在并協同作用：外排泵外排機制；核糖體保護機制；酶促降解機制[7]。四環素類抗生素外排泵屬于主要易化子超家族MFS[8]，是一種金屬-四環素/H+反轉運蛋白[9]。革蘭陽性菌中常見的四環素外排泵蛋白為TetK和TetL[10]。本研究針對分離獲得的寵物源MASR進行藥敏試驗，測定其對四環素類藥物的耐藥情況，并檢測外排泵相關基因。借助生物信息學及分子模擬技術，分析所檢出外排泵的進化規律及其作用方式，并對現有抑制劑利血平進行抑制活性的理論評價。以期為寧夏地區金黃色葡萄球菌的治療、防控提供一定有效參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器CHROM-agarTM金黃色葡萄球菌顯色培養基購自法國科瑪嘉生物公司；MH(A)瓊脂培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq PCR Master-Mix購自TaKaRa公司；藥敏紙片購自Oxoid公司。電熱恒溫培養箱(DNP-9272)購自上海精宏實驗設備有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自蘇州安泰空氣技術有限公司；電泳儀購自北京市六一儀器廠；全自動凝膠成像系統購自Bio-Rad公司。

1.2 MRSA分離鑒定于2019-2020年從寧夏地區不同寵物醫院采集樣品，經CHROM-agarTM金黃色葡萄球菌顯色培養基篩選、細菌基因組提取試劑盒提取DNA，再運用三重PCR方法擴增16S rRNA、nuc和mecA基因，測序后在NCBI網站中進行序列比對，以檢驗MRSA。參考HWANG等[11]的研究，確定三重PCR反應體系：25 μL 2×Multiplex Master Mix，1 μL模板DNA，10 μmol/L引物混合物(每種引物0.5 μmol/L)，并加雙蒸水將最終體積調整為50 μL，進行三重PCR反應。PCR反應條件：94℃ 15 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環；最終在72℃延伸10 min。通過在瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.3 藥敏試驗根據2019年美國臨床實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI 2019)[12]推薦的藥敏紙片瓊脂擴散法(K-B法)測定30株MRSA對16種抗菌藥物的敏感性，結果判定參照CLSI(2019)標準，分別以敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)3種形式記錄。

1.4 四環素耐藥基因檢測以基因組DNA為模板擴增基因tetK、tetM、tetO和tetL，所用PCR體系為20 μL：模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 10 μL，用雙蒸水補至20 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變形30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。將擴增產物送至生工生物(上海)股份有限公司測序，結果利用NCBI網站BLAST工具進行序列比對。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列相關信息

1.5 系統進化分析將測序獲得的tetK基因序列提交至NCBI網站，經BLAST同源比對，選取并下載與目的基因同源性≥90%的序列，使用CLASTAL X 1.83進行多序列比對，隨后借助MEGA 7.0及在線工具iTOL(https://itol.embl.de/)，基于Neighber-Joinning法構建系統發育樹。

1.6 結構特征分析借助Detaibio(https://mip.statscrop.com/www/detaibio.com)，Jpred4(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)和Predict-Protein(http://www.predictprotein.org/)在線工具進行蛋白二級結構預測；利用SWISS-MODEL(ttps://swissmodel.expasy.org)和Consurf Web Server(https://consurf.tau.ac.il/faq.php)網站進行外排泵蛋白的同源模建及保守性分析；通過PyMOL、插件Carver進行位點突變及分析蛋白通道。

1.7 分子對接及粗粒化動力學模擬利用分子對接軟件AutoDock 4.0、Vina及UCSF DOCK6，通過確定好的作用位點和本地區檢出的外排泵蛋白進行半柔性分子對接分析，其中計算外排泵蛋白與藥物分子親合能的公式：Eblind=EvdW+EHbond+Edesolv；借助在線工具CABS-flex(http://biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2/submit)進行粗粒化動力學模擬，分析TetK蛋白的結構柔性；以均方根波動(RMSF)反映蛋白中各氨基酸運動的自由度。

1.8 外排泵抑制試驗對51株MRSA分離株進行利血平對外排泵活性的抑制試驗，基于外排泵基因檢測結果對菌株進行分組，即攜帶與不攜帶2組；依次將培養至對數期的金黃色葡萄球菌菌液稀釋至D600=0.1，在96微孔板中每孔加入100 μL稀釋后菌液和100 μL不同濃度的四環素及多西環素藥液，隨后添加利血平使其終質量濃度達5 mg/L，置于37℃恒溫培養12 h后判讀MIC值。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定從寧夏地區不同寵物醫院采集樣品，使用CHRO-MagarTM金黃色葡萄球菌顯色培養基篩選，運用PCR方法擴增16S rRNA、nuc和mecA基因，最終確定239株全部為金黃色葡萄球菌，其中51株為MRSA，檢出率為21.34%(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker；1～7.樣品；8.陽性對照ATCC33591；9.陰性對照ATCC29213；10.空白對照圖1 顯色培養基上的金黃色葡萄球菌(左)及三重PCR擴增電泳圖(右)

2.2 藥敏試驗結果51株MRSA對16種抗菌藥物的耐藥情況見表2。由表2可知，四環素、多西環素、青霉素和克林霉素耐藥情況較為突出，耐藥率分別為78.43%，70.06%，82.35%，66.66%；而氨芐西林、左氧氟沙星和桿菌肽的耐藥率為45.10%～54.90%；對萬古霉素和利奈唑胺全部敏感。

表2 51株MRSA對16種抗菌藥物的耐藥率

2.3 四環素耐藥基因檢測以51株寵物源MRSA的基因組為模板，PCR方法擴增四環素耐藥基因tetK、tetM、tetO和tetL；結果如表3所示：tetM基因檢出率最高為90.20%，其次是tetK和tetL基因，檢出率分別為54.90%和49.02%，tetO基因未檢出。此外，對外排泵基因的多種攜帶方式進行分析，發現同時攜帶tetK+tetM與tetK+tetM+tetL基因的比例最高(49.02%)。

表3 51株MRSA耐藥基因攜帶情況

2.4 系統進化分析將tetK基因測序序列與NCBI數據庫中序列進行同源性比對，結果顯示tetK基因序列與StaphylococcusaureusUP403、JY22和Staphylococcussciuriwo19-3的相似性達100%，與StaphylococcussaprophyticusUTI-056、StaphylococcusaureusMJ015等相似性達99.69%。系統進化分析可知，本地區檢出的tetK基因與StaphylococcussaprophyticusCP05447.1、StaphylococcusaureusCP053184.1和StaphylococcusepidermidisCP043801.1等菌株攜帶的tetK基因聚于同于一支且自展值為100%，說明本地區檢出的tetK基因所在分支可信度高(圖2)。

圖2 基于tetK基因序列的系統進化樹

2.5 結構特征分析結果見圖3。TetK外排泵蛋白包含的α-螺旋為84.10%，非螺旋結構為15.9%。經跨膜域分析可知，胞內氨基酸占22.22%，胞外氨基酸占11.11%，跨膜氨基酸占66.67%。其后進行氨基酸保守性分析，并將保守程度投影至蛋白的三級結構，以研究氨基酸保守性與結構維持及功能發揮的相關性。分析發現，Met31-Pro38、Gly151-Gly160、Val382-Ser387及Ser393-Gly400等區域呈現出高度保守性。結合卷積神經網絡進行溶劑可及性和功能預測，值得注意的是，高度保守的氨基酸主要分布在蛋白內部(buried)并位于胞內和跨膜螺旋區域，這將對外排泵蛋白的結構維持和功能發揮起到重要作用。蛋白通道分析可知，Ser26、Glu29、Gly145、Gly151、Glu152、Ile276、Ser277、Ser393和Glu397等氨基酸圍繞形成較為寬闊的外排通道入口，Leu206-Phe218區域形成通道的出口；計算可知，蛋白通道直徑大小處于2.40～3.46?,且在蛋白通道入口處存在一段α-螺旋-無規則卷曲，可能對藥物進入通道造成影響。

圖3 TetK外排泵蛋白的結構特征分析

2.6 分子對接及粗粒化動力學模擬結果見圖4。對接發現，利血平的結合親和能最低(-41.00 kJ/mol)，四環素次之(-36.40 kJ/mol)，多西環素最高(-28.12 kJ/mol)。四環素C3位與Ser393可形成氫鍵作用，C10位和C11位均可與Glu152形成氫鍵作用。C7、C8、C9、C10位所在苯環可與Lys366、Ile276形成疏水作用，與Glu152形成π-陰離子作用。同時，多西環素C2位與Ser393、Ile276、Ser277形成氫鍵作用，C4位與Glu30、Glu152、Ser277形成氫鍵作用，C7、C8、C9、C10位所在苯環可與Por121、Met125形成疏水作用。利血平C42位與Glu30形成氫鍵作用，C35、C36、C37、C38、C39、C41組成的苯環與Pro121形成疏水作用，O1與Ser393形成氫鍵作用，O4與Ser370形成氫鍵作用，C40與Gly145、Ile307形成氫鍵作用。此外，粗粒化動力學模擬發現，藥物與TetK蛋白關鍵結合位點Glu30、Glu152、Ile276和Ser277的均方根波動(RMSF)減小，結構柔性降低。說明藥物和蛋白結合穩定，利于藥物與外排口袋的結合；也存在某些位點RMSF增大的情況，推測該種變化與氨基酸殘基間存在耦合關系和一定隱式構象有關。

圖4 四環素、多西環素和利血平與外排蛋白對接圖與粗粒化動力學模擬

2.7 外排泵抑制試驗結果見圖5～7。添加利血平可明顯影響四環素類藥物在MRSA菌株中的最低抑菌濃度(MIC)，并使其降低4～32倍。MIC的降低程度高于GIBBONS等[16]首次報道的利血平存在時的MIC值；同時，SUN等[17]報道，攜帶氧氟沙星外排泵的耐藥結核分枝桿菌在利血平存在時MIC下降2～32倍，該結果與本研究相近。此外，四環素與利血平配伍使用后，MIC值分別降低8和16倍的菌株分別占17.64%和43.14%。對于多西環素，添加利血平后MIC值下降相同倍數的菌株與四環素接近，分別為23.53%和31.37%。隨后進行的Pearson相關性分析，計算得到P≤0.05，表明四環素類藥物與利血平配伍使用，可有效降低細菌對該類藥物的耐藥性，tetK基因的攜帶，也將對細菌的耐藥性產生一定影響。

A.四環素；B.西環素+利血平；C.多西環素；D.多西環素+利血平圖5 51株MRSA 96孔板耐藥試驗

A.四環素作用于攜帶tetK基因的菌株；B.四環素作用于不攜帶tetK基因的菌株；C.多西環素作用于攜帶tetK基因的菌株；D.多西環素作用于不攜帶tetK基因的菌株圖6 tetK基因攜帶情況(左)及對MIC值的影響分析(右)

圖7 利血平添加與菌株耐藥性的相關性分析

3 討論

本研究從寧夏地區多個寵物醫院就診的動物分離鑒定出MRSA菌株51株，檢測其耐藥情況。結果顯示，除了對青霉素類藥物表現出較高耐藥性外，四環素和多西環素的耐藥率也高達78.43%和70.06%。眾所周知，MRSA菌株攜帶有mecA基因，因此對β-內酰胺類藥物具有較高的耐藥性。而tetK基因編碼形成的外排泵蛋白會攝取四環素并將其泵出細胞，增強MRSA菌株對四環素的耐藥性，但對米諾環素沒有明顯的攝取能力[9]。這與耐藥試驗中四環素和多西環素的耐藥情況高達70%以上，而對米諾環素表現為88.24%敏感，11.76%中介的結果相一致。在外排泵基因的檢測中，發現tetK外排泵基因的攜帶率較為突出。外排泵基因的攜帶在一定程度上導致了本地區MRSA耐藥性的增強。

外排泵存在于原核生物和真核生物中，其本質上是蛋白質[18]。外排泵鑲嵌在細菌細胞膜上，扮演運輸特定底物或一組結構相似的化合物的角色[19]。在二級結構中顯示保守性氨基酸大多位于胞內和跨膜螺旋上，且在后續的對接結果中，出現在藥物小分子5?范圍之內，推測這些氨基酸參與胞內藥物識別攝取與藥物外排的過程。在對蛋白通道進行構建后發現，形成蛋白通道的主要氨基酸為Asp、Asn、Glu、Gly、Pro等，其形成較為寬闊的外排通道入口，推測該種結構與藥物的攝取和結合具有緊密聯系；在藥物外排中發揮重要作用，同時為進一步研究該蛋白與四環素類藥物的識別、結合與外排奠定基礎。在結構特征分析中發現，蛋白通道入口處存在一段α-螺旋-無規則卷曲，該部分在經過粗粒化動力學模擬后顯示，該區域均方根波動(RMSF)較大，說明該部位結構柔性較高，外排蛋白與藥物結合時將可能產生多種構象，最終藥物在最優構象下結合進入外排通道。而對這一前庭部位進行位點突變預測后發現該區域均方根波動減小，結構柔性降低，可能會增大藥物進入外排通道的空間位阻，對藥物進入通道造成影響。

研究表明，對接位點主要包含Gly、Glu、Pro、Ser等[20-21]。分子對接發現，Gly、Ser可與藥物形成氫鍵作用。分子內的Gly和Ser可對蛋白質結構產生強烈影響，尤其是在α-螺旋內，甘氨酸殘基具有螺旋彈性并能實現緊密的螺旋-螺旋相互作用[22]。推測在這種作用下，蛋白擁有較強的結構柔性，較低的空間位阻，導致與藥物有較強的結合活性，有利于藥物的外排。此外，分子對接發現，Pro可與藥物分子形成疏水作用。幾乎所有轉運蛋白在多個α-螺旋中都有嵌入膜的脯氨酸殘基，這是轉運蛋白的一般特征[23]。但是沒有轉運功能的蛋白質跨膜片段中卻不存在脯氨酸殘基。因此人們普遍認為脯氨酸殘基在轉運蛋白中起著重要的功能性作用[24]。脯氨酸殘基由于其環結構引起的位阻而在α-螺旋結構中是不利的，它們的主鏈氮不可用于正常的氫鍵結合[25]，導致螺旋彈性較大，結構柔性增強；因此，可能產生較多優勢水解構象以便藥物小分子被外排蛋白抓取并排出，最終引起耐藥性增強。在對接過程中我們發現位于跨膜區的Glu30、Glu152、Glu397均可與藥物進行作用，推斷谷氨酸殘基在對四環素的轉運中也發揮著重要作用，這與FUJIHIRA等[21]的結果相一致。

據報道，四環素中4個環的完整線性排列是其發揮抗菌活性的首要條件，而C1-C4位的取代基又是抗菌活性的必要藥效基團[26]；C5-C9位的取代基為非活性必需基團，對其改造有助于克服核糖體保護機制和外排機制，進而提高藥物敏感性[27]。多西環素是將四環素C6位上的羥基轉移到C5位上，以此增大藥物進入外排通道的空間位阻，獲得比四環素更強的抗菌活性。分子對接發現，四環素與TetK蛋白的結合自由能(-36.40 kJ/mol)低于多西環素(-28.12 kJ/mol)，并能以較多氫鍵、范德華力等多種作用與TetK蛋白結合，這一發現提示，四環素可能更易于被外排泵攝取并排出菌體，與藥敏試驗呈現出四環素較高的耐藥率相一致。添加利血平后四環素類藥物的敏感性增加，表明利血平不僅對氟喹諾酮類藥物外排泵具有明顯抑制活性，也能在一定程度上對四環素類藥物外排泵發揮作用；這將為四環素類藥物耐藥性問題的解決提供有效參考。