pVAX-GHRH表達(dá)質(zhì)粒對D-半乳糖誘導(dǎo)老年動物骨質(zhì)疏松的影響

葉 睿，周 浩，陳 婷，孫加節(jié)，習(xí)欠云，張永亮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心 廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

在人和動物的一生中，骨一直經(jīng)歷著動態(tài)的重塑過程，破骨細(xì)胞移除舊骨或受損骨，成骨細(xì)胞形成新骨。在衰老過程中骨吸收與骨形成的平衡被破壞致使骨密度降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞[1]。老年狗和大鼠在衰老過程中骨量減少，骨骼強(qiáng)度降低[2-3]。骨質(zhì)疏松性骨折引起的疼痛、畸形和死亡嚴(yán)重影響老年人的健康。隨著老齡化社會的迅速上升，這些病例的數(shù)量將顯著增加[4]。同樣，如今隨著人們生活水平提高，寵物的數(shù)量越來越多，因此老年寵物的數(shù)量也越來越多，同樣，它們也會面臨骨質(zhì)疏松這類老年疾病問題。骨質(zhì)疏松癥的治療過去是長期的過程，如使用雙磷酸鹽和雌激素[5]。然而，在藥物治療過程中會有一些不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、腎毒性、骨髓性骨性，甚至增加腫瘤風(fēng)險(xiǎn)[6]，因此還需要研究新的骨質(zhì)疏松治療方法。

神經(jīng)內(nèi)分泌生長軸(GHRH-GH-IGF-Ⅰ軸) 是重要的內(nèi)分泌軸,該內(nèi)分泌軸中的生長激素(growth hormone,GH)和IGF-Ⅰ(insulin-like growth factor Ⅰ)在骨骼生理中均起重要作用[7-9]。但是隨著年齡的增長，GH和IGF-Ⅰ的水平顯著降低[10]。同樣隨著年齡的增長，家犬等寵物體內(nèi)的IGF-Ⅰ水平逐漸下降[11]。在中/大型犬中，年輕犬GH和IGF-Ⅰ濃度顯著高于老齡犬[12]。持續(xù)注射重組GHRH蛋白可以恢復(fù)正常的GH模式，并且不會使GHRH受體脫敏和抑制GH的分泌[13]。但是，由于重組GHRH蛋白在體內(nèi)半衰期短，需要經(jīng)常注射(1～3次/d)[14]。有研究表明，質(zhì)粒治療是可擴(kuò)展的，是一種有前景的方法，在大型動物模型和人類中可誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)蛋白的分泌[15-16]。給動物肌肉注射肌肉特異性啟動子控制表達(dá)的GHRH質(zhì)粒，可使動物體內(nèi)長時(shí)間維持高GH和IGF-Ⅰ水平[17-19]。與對照組相比，肌注pSK-GHRH可使小鼠血清GH至少升高2周，肝臟IGF-Ⅰ mRNA水平升高[20]。同樣，給比格犬注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒提高了其血清IGF-Ⅰ水平，且沒有發(fā)現(xiàn)副作用[21]。給老年寵物使用GHRH表達(dá)質(zhì)粒是可行的方法。

D-半乳糖是建立衰老模型的經(jīng)典物質(zhì)。通過注射D-半乳糖，發(fā)現(xiàn)該大鼠骨質(zhì)流失，骨小梁數(shù)量減少，表現(xiàn)出與老年男性骨質(zhì)疏松相似變化[22]。所以本試驗(yàn)以D-半乳糖復(fù)制老年性骨質(zhì)疏松模型。本試驗(yàn)通過給D-半乳糖衰老模型肌肉注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒，并結(jié)合電穿孔法處理，探究GHRH表達(dá)質(zhì)粒對骨質(zhì)疏松的防治作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料40只12月齡SPF級KM雌鼠購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司(許可證號:SYXK(湘)2019-0014)；pVAX-GHRH表達(dá)質(zhì)粒由本課題組(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院生理生化實(shí)驗(yàn)室) 構(gòu)建，保存于-80℃冰箱內(nèi)；D-半乳糖購自廣州華奇盛生物科技有限公司;B型活體基因?qū)雰x購自上海塔瑞莎健康科技有限公司;促生長激素釋放激素(GHRH)、胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和血清骨特異性堿性磷酸酶(BLAP)檢測試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 GHRH表達(dá)質(zhì)粒的制備與鑒定將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,在液體LB中培養(yǎng)細(xì)菌,SDS堿變性法提取質(zhì)粒后并純化。使用0.9%的NaCl溶液溶解質(zhì)粒,提取的質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ與XbaⅠ雙酶切鑒定和測序比對，質(zhì)粒由生工生物工程股份有限公司(上海)進(jìn)行測序。

1.3D-半乳糖造骨質(zhì)疏松模型及質(zhì)粒注射將40只KM雌鼠分為4組，每組10只。第1組為對照組，每天頸背部皮下注射生理鹽水，腿肌按80 μg/kg 注射pVAX空質(zhì)粒；第2組為質(zhì)粒組，每天頸背部皮下注射生理鹽水，腿肌按80 μg/kg注射 pVAX-GHRH質(zhì)粒；第3組為造模加質(zhì)粒組，頸背部皮下按每天500 mg/kg注射D-半乳糖，連續(xù)7周，腿肌按80 μg/kg注射 pVAX-GHRH質(zhì)粒；第4組為造模組，頸背部皮下按每天500 mg/kg注射D-半乳糖，連續(xù)7周。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在第3周腿肌注射質(zhì)粒并活體基因?qū)雰x電擊(36 V、5 Hz)處理。

1.4 取樣及處理在質(zhì)粒注射處理后0，1，3周采用下頜靜脈叢采血，第5周采用眼球取血。眼球取血后處死，分離血清，保存于-80℃環(huán)境。分離兩側(cè)股骨，清除肌肉組織與結(jié)締組織固定于多聚甲醛中，右側(cè)股骨用于做Micro-CT掃描。左側(cè)股骨保存于-80℃環(huán)境，用于相關(guān)基因表達(dá)測定。

1.5 血清GHRH和IGF-Ⅰ檢測將注射質(zhì)粒后0，1，3，5周的血清常溫靜置解凍，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清GHRH和IGF-Ⅰ的水平。

1.6 骨代謝指標(biāo)檢測取注射質(zhì)粒后5周血清，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TRAP和BLAP的水平。

1.7 Micro-CT對小鼠股骨的分析將小鼠股骨附著組織剔除干凈,放入Micro-CT儀,對股骨干骺端進(jìn)行X射線掃描。掃描完成后,選取感興趣區(qū)域(region of interest,ROI) 行三維重建,使用軟件進(jìn)行重建定量分析。獲得以下參數(shù)：骨密度(bone mineral density,BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)、連接密度(connectivity density,Conn.D.)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model index,SMI)。

1.8 股骨HE染色4%多聚甲醛固定股骨，進(jìn)行脫鈣處理，待脫鈣完成達(dá)到切片標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后制作成石蠟切片，并進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織形態(tài)，并拍照。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCRRT-PCR檢測骨組織相關(guān)基因的表達(dá)量。取20 mg骨組織，使用Trizol法提取總RNA，經(jīng)消化和反轉(zhuǎn)獲得cDNA，加入相應(yīng)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 pVAX-GHRH質(zhì)粒測序結(jié)果與目的序列比對pVAX-GHRH質(zhì)粒用NheⅠ與XbaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后，結(jié)果如圖1所示，pVAX-GHRH質(zhì)粒雙酶切分別在500,2 500 bp處出現(xiàn)條帶，與理論酶切片段大小一致，而且質(zhì)粒的測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的基因序列相同，由此證明質(zhì)粒的正確性。

1，2.pVAX-GHRH質(zhì)粒雙酶切；M1.DL2000 DNA Marker；M2.DL5000 DNA Marker圖1 pVAX-GHRH質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 血清中GHRH和IGF-Ⅰ的含量變化注射GHRH質(zhì)粒組血清GHRH濃度在第1，3周時(shí)較對照組顯著升高,血清IGF-Ⅰ濃度在第3周顯著高于未注射GHRH組。結(jié)果表明,注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒能在較長時(shí)間內(nèi)增加小鼠血清GHRH和IGF-Ⅰ水平(圖2)。

圖2 各組血清中GHRH濃度(左)和IGF-Ⅰ濃度(右)變化

2.3 股骨Micro-CT掃描指標(biāo)見表2。與空質(zhì)粒組相比注射GHRH質(zhì)粒組小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Conn.Dn都有所增加，并且Tb.Sp降低，說明GHRH可以增加12月齡小鼠皮質(zhì)骨和小梁骨的骨量，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著水平，其原因可能是樣本數(shù)較少。與空質(zhì)粒組相比注射D-半乳糖可以顯著降低了12月齡小鼠的股骨骨量，破壞骨結(jié)構(gòu)，說明注射D-半乳糖成功導(dǎo)致了小鼠的骨質(zhì)疏松。通過給造模組注射GHRH質(zhì)粒增加了股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.Dn，并且降低了Tb.Sp和SMI，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著水平。

表2 各組小鼠股骨Micro-CT骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)分析(n=3)

2.4 股骨Micro-CT二維圖(2D)和三維圖(3D)觀察結(jié)果3D圖反映骨小梁的厚度分布情況,顏色從綠到紅,反映骨小梁從薄到厚，2D圖可見骨髓腔內(nèi)骨小梁數(shù)量。與空質(zhì)粒組相比，注射GHRH質(zhì)粒組小鼠股骨小梁骨骨量更多，排列更加致密，空隙減少。D-半乳糖造模組骨小梁較細(xì)，數(shù)量較少，有斷裂，并且有很大空隙。造模注射GHRH質(zhì)粒組相比于造模組的骨小梁厚度增加，數(shù)量也較多，中間空隙有所減少(圖3)。

圖3 各組股骨Micro-CT三維圖和二維圖

2.5 股骨組織病理學(xué)形態(tài)分析由圖4可見，HE染色結(jié)果顯示，注射GHRH質(zhì)粒組比空質(zhì)粒組股骨結(jié)構(gòu)更完整，小梁骨數(shù)量和面積更多，造模組骨小梁數(shù)量顯著減少，造模后注射GHRH質(zhì)粒組的骨小梁數(shù)量較造模組又有所增加，結(jié)構(gòu)也比較完整。經(jīng)過Image-Pro Plus 6.0 軟件對骨小梁面積進(jìn)行分析可見，注射GHRH質(zhì)粒組的小梁骨面積占比有所增加，D-半乳糖造模組小鼠，骨小梁面積占比明顯降低(P<0.05)，而給造模組注射GHRH質(zhì)粒組的骨小梁面積占比增加(P<0.05)；說明注射GHRH質(zhì)粒后，小鼠骨質(zhì)丟失減少。

圖4 小鼠股骨組織HE染色(左)及小梁骨面積占比(右)(20×)

2.6 骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)相對于空質(zhì)粒組，GHRH質(zhì)粒組血清中TRAP和BLAP沒有明顯變化，D-半乳糖造模組血清中TRAP含量顯著升高(P<0.05)、BLAP含量顯著降低(P<0.05)，表明注射D-半乳糖促進(jìn)了破骨活動，并且抑制了成骨。注射GHRH質(zhì)粒提高了造模組小鼠BLAP的含量(P<0.05)，說明GHRH表達(dá)質(zhì)粒能促進(jìn)造模組的骨形成，但對TRAP沒有影響(圖5)。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著P<0.05，相同字母表示差異不顯著P>0.05。下同圖5 各組血清中骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)

2.7 股骨的骨形成與骨吸收相關(guān)基因表達(dá)變化相對于空質(zhì)粒組，注射GHRH質(zhì)粒組的股骨中成骨和破骨相關(guān)基因表達(dá)量沒有顯著性差異。使用D-半乳糖造模能顯著降低成骨相關(guān)因子OPG和OCN的表達(dá)且骨吸收相關(guān)因子TRAP和RANKL的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。相對于造模組，造模且注射GHRH質(zhì)粒組的OPG和OCN表達(dá)有所增加，TRAP和RUNX2表達(dá)有所降低，但未達(dá)到差異顯著水平。

圖6 各組股骨中骨形成(OPG、OCN)和骨吸收(TRAP、RUNX2)相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量

3 討論

寵物能夠豐富人類的生活，獸醫(yī)學(xué)專家和生物學(xué)家通過研究發(fā)現(xiàn)，接觸寵物能改變心情，減輕病癥和疼痛，改善人們身心的機(jī)能。伴侶動物能夠幫助兒童培養(yǎng)自信和自尊心，培養(yǎng)兒童的領(lǐng)導(dǎo)欲和責(zé)任心；它們?yōu)槔夏耆藥碛H情、友情，給了老年人以精神寄托；工作犬可幫助殘疾人料理日常生活[23]。《2019中國寵物行業(yè)白皮書》數(shù)據(jù)顯示，全國城鎮(zhèn)寵物犬、貓數(shù)量達(dá)9 915萬只，比上一年增長8.6%。以此趨勢，寵物的基數(shù)會越來越大。老年犬、貓的數(shù)量也會越來越多，隨著它們不斷衰老，與之而來的還有各種老年疾病。隨著年齡的增長，骨骼重塑持續(xù)減緩，由此導(dǎo)致的骨骼代謝失衡開始導(dǎo)致骨骼骨重逐漸流失[24]。骨小梁和皮質(zhì)骨均受影響，由于骨量的減少使骨骼強(qiáng)度顯著降低，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[25]。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的骨骼相關(guān)疾病[26]。因此老年性骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響著老年動物的健康。

D-半乳糖是建立衰老模型的經(jīng)典物質(zhì)，其致衰老機(jī)制是指在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)給動物注入一定量D-半乳糖，可導(dǎo)致其機(jī)體細(xì)胞內(nèi)D-半乳糖濃度增高，過量的D-半乳糖在半乳糖還原酶的作用下可以轉(zhuǎn)化為半乳糖醇，由于半乳糖醇不能進(jìn)一步代謝，在細(xì)胞內(nèi)積累，從而影響正常的滲透壓，進(jìn)而可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的表達(dá)增加，抗氧化劑表達(dá)減少，抗氧化防御系統(tǒng)惡化，從而形成更多的自由基導(dǎo)致機(jī)體衰老[27]。注射D-半乳糖促進(jìn)了小鼠的骨吸收并且抑制了骨形成。通過對股骨進(jìn)行Micro-CT掃描和切片分析可見，注射D-半乳糖嚴(yán)重破壞了骨微結(jié)構(gòu)，減少了小鼠骨量。

GH和IGF-Ⅰ在骨吸收和骨形成的平衡中發(fā)揮重要作用。GH的許多功能是通過IGF-Ⅰ的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的，IGF-Ⅰ被廣泛認(rèn)為是骨骼生長、發(fā)育和代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子[24]。并且GH受體(GHr)和IGF-Ⅰ受體(IGF-Ir)存在于骨組織中[28]。通過組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測量發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ的作用促進(jìn)骨基質(zhì)結(jié)合率的增加[29]。對骨形成和骨吸收的生化標(biāo)志物檢測證明了rhGH和IGF-Ⅰ均可誘導(dǎo)老年人骨轉(zhuǎn)換的增加[30]。IGF-Ⅰ通過影響縱向和橫向骨累積以及在成年后期和老年期間維持骨量，在生長中的骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用[31]。GHRH可刺激垂體GH的合成和分泌[32]。動物衰老過程中，GHRH-GH-IGF-Ⅰ軸的激素分泌會發(fā)生變化。老年大鼠垂體GH mRNA、GH含量及生長激素釋放激素受體(GHRHr)顯著降低[33]。大鼠與年齡相關(guān)的GH分泌減少似乎是由GHRH分泌減少引起的[34]。動物垂體GH 的分泌釋放受下丘腦釋放的GHRH和生長抑素(somatostatin，SS)的調(diào)控，GHRH 促進(jìn)垂體釋放GH而SS抑制GH的釋放[35]。而GH由垂體體細(xì)胞以脈動的方式分泌，通過刺激IGF-Ⅰ合成和分泌，直接或間接作用于周圍組織[10,36]。pcDNA3-GRF(1-32)質(zhì)粒通過肌肉注射給家兔，注射后31 d注射部位肌肉中GRF重組質(zhì)粒仍能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并表達(dá)[37]。電轉(zhuǎn)化法可以提高基因在動物體內(nèi)的表達(dá)效率[38]。它可以用低劑量的單一質(zhì)粒治療多種疾病并產(chǎn)生長期療效[39]。本試驗(yàn)中，給小鼠注射pVAX-GHRH表達(dá)質(zhì)粒在較長時(shí)間內(nèi)顯著增加了小鼠血清中GHRH和IGF-Ⅰ的含量。通過Micro-CT掃描結(jié)果與股骨組織病理學(xué)形態(tài)分析給D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠老年骨質(zhì)疏松肌肉注射pVAX-GHRH質(zhì)粒，能夠回復(fù)部分D-半乳糖導(dǎo)致的骨量減少。但是，在對血清骨代謝標(biāo)志物都無明顯影響,可能是因?yàn)椋谧⑸銰HRH質(zhì)粒35 d時(shí)血清中GHRH和IGF-Ⅰ水平已經(jīng)回到與對照組相同的水平，所以對骨代謝標(biāo)志物的影響無顯著性差異，對骨量的促進(jìn)作用不是特別明顯可能是因?yàn)樽饔脮r(shí)間不夠長，由于用于進(jìn)行Micro-CT掃描的樣本量較少(n=3)所以可能使統(tǒng)計(jì)結(jié)果沒有差異。

骨質(zhì)疏松癥的治療方法都在通過抑制骨吸收以及促進(jìn)形成來預(yù)防骨折[40]。用于治療老年骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有雙磷酸鹽、激素治療和骨質(zhì)疏松癥營養(yǎng)補(bǔ)充劑[41]。雙磷酸鹽可預(yù)防病理性骨折，促進(jìn)骨愈合，同時(shí)抑制骨吸收，減少骨質(zhì)流失，增強(qiáng)骨質(zhì)重塑過程，可以顯著促進(jìn)骨質(zhì)疏松人和犬的骨礦物質(zhì)密度[42-44]，但是在使用過程中會導(dǎo)致頜骨壞死、食管癌和腎功能衰竭等嚴(yán)重不良反應(yīng)[45-46]。在雌性動物中雌激素缺乏與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率和嚴(yán)重程度增加密切相關(guān)[47]，雌激素替代療法預(yù)防骨丟失和骨折已經(jīng)在組織形態(tài)學(xué)和流行病學(xué)上得到證實(shí)[48]，雌激素療法會增加深靜脈血栓、膽囊疾病等風(fēng)險(xiǎn)[49]，使用雌激素治療成本也較高，當(dāng)治療停止時(shí)，雌激素的骨骼益處會迅速消失[45]。鈣和維生素D攝入不足也會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。維生素D的經(jīng)典功能是刺激腸道鈣和磷酸鹽的吸收，和腎對鈣和磷酸鹽的再吸收和調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)代謝[50]，并且犬、貓無法通過陽光照射進(jìn)行維生素D皮膚合成[51]。但是，維生素D與鈣結(jié)合使用只在骨質(zhì)疏松初級預(yù)防中起作用[52]，使用鈣補(bǔ)充劑可能對心血管產(chǎn)生不良影響[53]。目前，在對不同基因疫苗研究表明，其對受體動物是相對安全的。利用電轉(zhuǎn)化優(yōu)化質(zhì)粒DNA基因或DNA疫苗傳遞不會對組織產(chǎn)生損傷[54]，并且不需要頻繁的服用或注射。這種治療疾病的新策略是在生理水平上連續(xù)長期產(chǎn)生蛋白質(zhì)，最大限度地減少副作用，并可能產(chǎn)生長期有益的效果[15]。在我們的試驗(yàn)過程中，在小鼠體內(nèi)也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。

綜上所述，注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒可以增加血清中GHRH和IGF-Ⅰ含量，增加骨質(zhì)疏松小鼠股骨骨量，因此注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒能夠在一定程度上改善老年骨質(zhì)疏松，有希望發(fā)展成為一種用于改善動物老年骨質(zhì)疏松癥的藥物。