基于AMPK-mTOR信號通路探討黑果枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬的影響

武 強,薛才華，王夢杰，劉嘉華，張龍飛，屠園園，吳 華

(青海大學 農牧學院，青海 西寧 810016)

細胞自噬(autophagy)是真核生物進行自我保護的一種機制，主要是通過溶酶體對細胞內的蛋白質和細胞器進行融合降解從而達到細胞穩(wěn)態(tài)[1]。目前，為了解自噬的免疫機制都會深入研究自噬的調節(jié)通路。其中,mTOR信號通路是最常見的通路之一,mTOR介導的信號通路是調控細胞能量和營養(yǎng)代謝的重要樞紐。當細胞在營養(yǎng)缺乏、新陳代謝紊亂、炎癥反應及外界壓力的刺激下,細胞會產生相應的應激反應,mTOR的活性會降低，同時激活細胞的自噬；當細胞營養(yǎng)充足時,mTOR活性又會被激活，從而抑制細胞自噬[2]。

從植物提取出來的花青素顏色呈紫紅色，屬于花色苷類色素，屬于黃酮類物質，天然可食用。人們常將黑果枸杞稱為“花青素之王”[3]。黑果枸杞中的花青素功能較多，在細胞免疫功能上，目前的研究主要有增強淋巴細胞增殖、促進腫瘤細胞的凋亡[4]。巨噬細胞是體內的“打掃機器”，在免疫系統(tǒng)功能中起重要的作用。它不僅能夠清除體內壞死的細胞和病原體，還能與溶酶體融合形成自噬溶酶體，以有效殺傷清除細菌[5]。因此，本試驗擬通過AMPK-mTOR信號通路探討黑果枸杞花青素對小鼠巨噬細胞Raw264.7自噬的影響，從細胞自噬層面揭示黑果枸杞花青素的免疫機理。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑小鼠巨噬細胞株RAW264.7，購買于中國科學院上海細胞庫；黑果枸杞花青素購自青海金麥杞生物科技有限公司(純度61%、灰分0.6%、蛋白質6%、糖1.32%、氨基酸3.56%)；DMEM干粉、胎牛血清均購自Gibco公司；PBS購自Hfart公司；胰蛋白酶EDTA溶液0.25%購自Solarbio公司；雷帕霉素(RAPA)購自MedChemExpress公司；TRizol Universal總RNA提取試劑盒、 cDNA反轉錄試劑盒和Super Real彩色熒光定量預混試劑盒購自天根生化科技有限公司；山羊抗IgG購自Abcam公司；P-AMPK抗體購自BOSTER公司；P-mTOR抗體購自SAB公司；Ant-GAPDH購自Immunoway公司；MDC試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 主要儀器超凈工作臺，購自江蘇通凈凈化設備有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱，購自美國NUAIRE公司；高速低溫離心機，購自英國Dynamica公司；PCR儀及熒光定量系統(tǒng)購自BIO-RAD；Western blot 轉膜儀、Western blot 電泳儀、Western blot 電源均購自北京六一生物科技公司；搖床購自美國SCILOGEX公司；化學發(fā)光成像儀購自北京賽智科技有限公司。

1.3 試劑配制黑果枸杞花青素溶液的配制：將黑果枸杞花青素溶解于的DMEM培養(yǎng)基中，配置質量濃度為100 mg/L 的黑果枸杞花青素溶液為母液稀釋使用，4℃冰箱避光保存；雷帕霉素抑制劑：精確稱取0.091 4 g雷帕霉素加入1 mL的DMSO溶液，配制成濃度為100 mmol/L的母液稀釋使用，置于-20℃ 冰箱保存，試驗中雷帕霉素的最終濃度為100 nmol/L。

1.4 細胞培養(yǎng)將小鼠巨噬細胞RAW264.7 置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每24 h換液1次，待細胞生長約70%～80%融合時將其傳代，2～3 d進行1次細胞傳代，傳代培養(yǎng)足夠的細胞以備用。

1.5 MDC染色法檢測自噬體將細胞以每孔1×105細胞數(shù)接種至24孔板，設花青素質量濃度為0,12.5,25.0,50.0,100.0 mg/L，每組3個孔重復，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，使用細胞自噬染色檢測試劑盒行MDC染色。具體操作步驟如下：300 μL 1×wash Buffer洗 1 次，加入10 μL 的MDC染液，輕輕混勻；室溫避光染色 30 min，300 μL 1×wash Buffer 洗3次，加入100 μL 的 collection Buffer，使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 實時熒光定量PCR檢測自噬相關因子mRNA的表達以細胞濃度為1×105接種至6孔細胞培養(yǎng)板后常規(guī)培養(yǎng)，待細胞達到70%～80% 融合時分組處理，每組3個重復。黑果枸杞花青素處理24 h后提取細胞總RNA，提取方法按照天根生化科技有限公司生產的TRizol Universal說明書進行操作，提取的RNA在微量核酸蛋白測定儀測定濃度及純度。采用天根生化科技有限公司的cDNA 反轉錄試劑盒進行RNA逆轉錄反應和Super Real彩色熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR反應，引物由上海生工生物公司合成。使用 Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System 對各組樣本進行擴增，記錄各樣品擴增Ct值，采用2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達量。

1.7 Western blot 檢測自噬相關因子蛋白的表達分別收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。用30 μL 5×上樣緩沖液與120 μL蛋白樣本混合于200 μL的離心管中，于PCR儀上變性后泳道上樣，經 SDS-PAGE 電泳后，半干轉膜至PVDF膜，按比例配制 LC3-Ⅱ抗體、Beclin-1抗體、Ⅲ-PI3K抗體及 GADPH 抗體，4℃封閉過夜。TBST洗膜，室溫5×6 min 搖洗，加入山羊抗IgG二抗，室溫1 h后TBST洗膜，室溫5×6 min搖洗。將保鮮膜置于暗盒中，可以在其底部加水以固定薄膜，將PVDF膜正面(蛋白附著面)朝上，放置于薄膜里。將發(fā)光液試劑盒中2種液體按1∶1比例混合，搖勻。滴加到PVDF膜上，反應5 min。用鑷子夾起PVDF膜一角，使發(fā)光液自然流下，曝光顯影觀察。

1.8 數(shù)據(jù)分析采用Image J對條帶量化，所有試驗數(shù)據(jù)經Excel軟件初步處理后，采用SPSS Statistics 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，鄧肯氏法進行多重比較， Graphpad Prism 8.0軟件進行繪圖。

表1 自噬因子mTOR和AMPK引物序列

2 結果

2.1 不同質量濃度黑果枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬體的影響細胞經MDC染色后，結果顯示，對照組內含有少量熒光，花青素12.5 mg/L 組的熒光明顯減少,花青素25.0,50.0,100.0 mg/L組看不到熒光(圖1)。

圖1 不同質量濃度花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬體的影響

2.2 黑果枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬相關因子mRNA表達的影響結果顯示,與對照組相比，花青素組極顯著降低AMPK因子的mRNA表達(P<0.01)，極顯著升高mTOR因子的mRNA表達(P<0.01)(圖2)。

圖2 黑果枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬相關因子 mRNA表達的影響

2.3 黑果枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬相關因子蛋白表達的影響結果顯示,與對照組相比，花青素組極顯著降低p-AMPK的蛋白表達(P<0.01)，極顯著升高p-mTOR因子的蛋白表達(P<0.01)(圖3)。

圖3 黑果枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬相關因子蛋白表達的影響

2.4 黑果枸杞花青素結合雷帕霉素對自噬相關因子mRNA表達的影響結果顯示,與對照組相比，雷帕霉素組極顯著增加了AMPK因子的mRNA表達(P<0.01)，花青素+雷帕霉素組極顯著降低了AMPK因子的mRNA表達(P<0.01)；雷帕霉素組極顯著降低了mTOR因子的mRNA表達(P<0.01)，花青素+雷帕霉素組極顯著降低了mTOR因子的mRNA表達(P<0.01)。與雷帕霉素組相比，花青素+雷帕霉素組極顯著降低了AMPK因子的mRNA表達(P<0.01)；花青素+雷帕霉素組mTOR因子的mRNA表達差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

注：與對照組相比,*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。與雷帕霉素相比，##表示差異極顯著(P<0.01)。下同圖4 黑果枸杞花青素結合雷帕霉素對自噬因子AMPK和mTOR mRNA表達的影響

2.5 黑果枸杞花青素結合雷帕霉素對自噬相關因子蛋白表達的影響結果顯示，與對照組相比，雷帕霉素組極顯著增加了p-AMPK因子的蛋白表達(P<0.01)，花青素+雷帕霉素組顯著降低了p-AMPK因子的蛋白表達(P<0.05)；雷帕霉素組極顯著降低了p-mTOR因子的蛋白表達(P<0.01)，花青素+雷帕霉素組顯著降低了p-mTOR因子的蛋白表達(P<0.05)。與雷帕霉素組相比，花青素+雷帕霉素組極顯著降低了p-AMPK因子的蛋白表達(P<0.01)；花青素+雷帕霉素組p-mTOR因子的蛋白表達差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

圖5 黑果枸杞花青素結合雷帕霉素對自噬因子p-AMPK和p-mTOR 蛋白表達的影響

3 討論

巨噬細胞在機體的特異性和非特異性免疫過程中都起著很重要的作用，它不僅能直接吞噬病原微生物，還能作為抗原遞呈細胞參與抗原的攝取、加工和處理過程，激發(fā)細胞和體液免疫反應[6]。自噬是巨噬細胞吞噬和清除體內病原微生物的重要調控機制，有研究表明，巨噬細胞的自噬功能下降可以降低其對體內凋亡細胞吞噬的效率[7]。

細胞自噬是一個動態(tài)的過程，主要可分為4個階段，即自噬的誘導、自噬體形成、自噬溶酶體形成和自噬體降解。細胞在被誘導發(fā)生自噬后，首先在胞漿內會形成一種杯狀的囊泡樣結構，稱為隔離膜(isolation membrane)或吞噬泡(phagopore)，并集結需降解的胞漿成分；然后隔離膜進一步延伸將胞漿成分包裹形成一個封閉的雙層膜的結構，這一結構稱為自噬體(autophosome)；自噬體隨后在胞漿內轉運至溶酶體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后被包裹的胞漿成分在溶酶體酶的作用下被降解，其降解產物在細胞內可被循環(huán)利用[8]。因此，觀察自噬體的熒光聚積程度可以判斷自噬水平的強弱[8]。本試驗通過MDC法檢測自噬體，結果顯示黑果枸杞花青素誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7后自噬體減少，表明黑果枸杞花青素可以抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬。

mTOR是由高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，它的主要作用是調控細胞的生長和新陳代謝[9-10]。mTOR激酶活性的降低能促進細胞自噬，進而可以使細胞適應環(huán)境的改變，這些改變包括生長緩慢以及分解代謝旺盛[11]。mTOR信號通路是多條信號通路的匯聚點，通過對上、下游信號的傳導來影響細胞自噬，現(xiàn)已成為目前研究最多的信號通路。mTOR的上游通路主要是AMPK-mTOR信號通路，AMPK(adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase)是細胞中感受能量狀態(tài)調節(jié)代謝的一個蛋白激酶,在自噬發(fā)生的調控中也發(fā)揮著重要的作用[12]。AMPK磷酸化可以激活mTOR的下游基因ULK1，導致自噬的發(fā)生[13]。同時mTOR的磷酸化可以通過抑制ULK1的活性抑制自噬[14]。因此AMPK不僅可以直接激活ULK1而且可以通過負調節(jié)mTOR阻斷其對ULK1的抑制作用來促進自噬[15]。本試驗結果顯示，黑果枸杞花青素能顯著降低AMPK的mRNA和p-AMPK的蛋白表達水平，能顯著增加mTOR的mRNA和p-mTOR的蛋白表達水平，表明其可以抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬，且可能與AMPK-mTOR通路有關。結合雷帕霉素抑制劑結果表明，黑果枸杞花青素能顯著降低AMPK的mRNA和p-AMPK的蛋白表達水平，表明其可能通過抑制AMPK-mTOR 信號通路關鍵因子AMPK抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬。

綜上所述，黑果枸杞花青素可以抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬，且可能與AMPK-mTOR 信號通路關鍵因子AMPK有關。